Способ получения генетически трансформированных растительных объектов

(либо с конного конца), - ф -реципиент, Оцированных ду, перенос О Реду, отборс) ллусэ одике, ом ла- лекса ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ(57) Изобретение относится к клеточной игенетической инженерии, а именно к получению клеточных линий и растений с новыИзобретение относится к клеточной игенетической инженерии, а именно к получению клеточных линий и растений с новыми наследственными свойствами,Целью изобретения является трансформация как одиночных клеток, так и клеток всоставе растительных структур различныхвидов растений и повышение количестватрансформированных клеток,Предлагаемый способ состоит, из следующих этаповподготовка объекта-реципиента (выделение протопластов, клеток, каллусов, получение меристели и эмбрионов и т.д.),подготовка трансформирующих фактороввыделение плазмид, митохондрий, хлоропластов), изготовление микроинструмента.фиксация микроинструментаи фиксацияобьекта в камере (присоска, заливка в агаои механическая фиксация), заполнение иглы ми наследственными свойствами. Целью изобретения является трансформация как одиночнь,х клеток, так и клеток в составе растительных структур различных видов растений и повышение количества трансформированных клеток. Способ получения генетически трансформированных растительных объектов состоит из следующих этапов, подготовка объекта-реципиента и трансформирующих факторов, изготовление микооичстр, мента, фиксация микроинструмента и объекта в камере, дополнение микроиглы трансформирующим фактором, введение иглы в объект-реципиент, инъекция. перенос инъецированных объектов на питательную,. а затем на селективную среду. отбор трансфоомэнтов и регенерация трансформированных растений,трэн формирующим факточика иглы, либо с противоположвведение кончика иглы в объекинъекция, перенесение иньеобьектов на .питательную среобъектов на селективную с трансформантов, регенерация трансформированных растений.П р и м е р 1, Инструменты для манипуляций изготавливают из стандартных заготовок - стеклянных капилляров диаметром 1 мм на микрокузнице, Используют три вида инструмента: микроиглу, диаметр кончика менее 1 мкм, микроприсоску, диаметр 1 О мкм и коллектор для отбора инъецированных объектов, диаметр 100 мкм, Протоплэсты, выделенные из ка Юсот 1 апа беЬпеу 1 по стандартной мет помещают в микрокэмеру в стерип минэрном боксе, С помощью ко1698291 Составитель Н.КуэенковэТехред М,Ь 1 оргенгэл Корректор Н Ревскэя Редактор ТЛаэоренко Заказ 43 б 8 Тираж ПодписноеВНИИПК Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР13035, Москва, Ж, Раушскэя наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 микроманипуляторов КМ, в протопластвводят микроиглу, выдавливают через нееплазмиду рБЧ 2 че 0, коллектором отбираютинъецированную клетку и помещают ее напитательную среду,Иэ 93 иньецированных протопластовполучено 13 клеточных линий, устойчивых к, канамицину и способных к росту на среде,содержащей 30 - 240 мг/л антибиотика канамицина сульфата. Эффективность транс формации составляет 14;4, Из трехустойчивых линий регенерированы растения,П р и м е р 2. Инструменты и проведениеэксперимента аналогично примеру 1. Одиночные клетки МлаЬасцгп, полученные изрегенерирующих протопластов на 2-7-йдень после выделения, трансформируютплазмидой р 5 Ч 2-Кео, Из 20 иньецированных клеток полученО 3 клеточные линии, устойчивые к канамицину и способные к ростуна среде, содержащей 30 - 240 мг/л антибиотика канамицина сульфата.П р и м е р 3, Получают микроколонииклетокусорегзсоп езсцептцгп из одиночных клеток, В камеру помещают микроколонию в агаре, в одну из клеток вводятмикроиглу и выдавливают плазмидурОЧ 0319, При введении в 95 микроколонийполучено 18 клеточных линий, способных кросту на безгормонал ной среде, Эффективность трансформации составляет 19%,Трансформированные микроколонии переносят на питательную среду,П р и м е р 4, В корневой волосокТгап 1 еа Ьодотепзз .,бесцветная, не содержащая хлороплэстов клетка) в 10 опытахбыли введены хлоропласты Исо 1 апасаЬасцгп. Для этого растение Т.Ьо 9 оепзз помещают в камеру на предметном столикемикроскопа и через микроиглу диаметромкончика 3-5 мкм выдавливают хлоропласты,Хлоропласты в микроиглу набирают с пр,5 тивоположного конца, После иньекц:,и растение помещают в среду для выращивания,Через неделю после введения хлоропласты были найдены в 9 клетках - корневыхволосках, значительно выросших эа это вре 10 мя,Эффективность предлагаемого способазаключается в значительном повышенииэффективности трансформации растительных клеток до 10-20 по сравнению с мак 15 симально достигаемым 1;) уровнем уизвестных способов; универсальности поотношению к обьектам-оеципиентам итрансформирующим факторам; стандартности манипуляций необходимых для получе 20 ния широкого круга трансформантов,вовлечении в генноинженерные манипуляции широкого круга сельскохозяйственноважи ых растений, нап ример зла ко вы х.Формула изобретения25 Способ получения генетически трансформированных растительных обьектов, о тл и ч э ю щ и й с я тем, что, с цельютрансформации как одиночных клеток, так и клеток в составе растительных структур30 различных видов растений и повышения количества трансформированных клеток,трансформацию осуществляют выдавливанием экэогенного молекулярно-гене 1 ического материала и автономию35 реплицирующихся клеточных органелл через микроиглу, введенную в клетку, с последующей селекцией кле 1 очных линий ирастений с новыми наследственными свойствами,40