Способ определения содержания фибронектина в биологических жидкостях

/5 01 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) У. 1 аЬ. СИп, Ме М 39осударственн меди ти. Федоров и 3 - 180,1985,106,4, р. ОДЕ РЖА- ЛОГИЧЕласти медиатологии и ерапии, инможет быть количества ронектина в об гем т(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯНИЯ ФИБРОНЕКТИНА В БИСКИХ ЖИДКОСТЯХ(57) Изобретение относится кцины, преимущественно ктрансфузиологии, хирургии,фекционным заболеваниям, ииспользовано для определенияфункционально активного фиб Изобретение относится к области медицины, преимущественно к гематологии и трансфузиологии, хирургии, терапии, инфекционным заболеваниям и может быть использовано для определения количества функционально активного фибронектина в биологических жидкостях,Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности за счет определения содержания функционально активного фибронектина.П р и м е р 1, В качестве биоспецифического сорбента используются формалиниэированные эритроциты барана тип 2 (Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И, Мечникова). Их отмывают от консерванта 0,2 М фосфатным буфером рН 7.2 - 7,3,биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение специфичности и чувствительности спссоба определения содержания функционально активного фибронектина. Положительный эффект достигается определенной последовательностью приемов обработки поверхности формалиниэированных эритроцитов барана при следующих соотношениях компонентов: 1 объем 100-ных формалинизированных эритроцитов барана. 1 обьем 100-ного медицинского желатина: 1 объем 25-ного глютарового альдегида и 9 объемов фосфатного буфера. Количественное определение функционально активного фибронектина основано на торможении реакции гемагглютинации желатином, содержащимся в инкубационной среде, с последующим вычислением концентрации фибронектина по предлагаемой формуле. инкубируют в 0,5 М трис-НС буфере рН 7,4 - 7,6, содержащим 10 мМ .СаС 2 и 0,01 трипсина, при 37 С в течение 30 мин. Трипсин и продукты гидролиза удаляют 3 - 4- хкратной промывкой 0,05 М трис-НС 1 буфером рН 7,4-7,6 и затем промывают 0,9;ь-ным раствором хлористого натрия.В центрифужную пробирку вносят 900 мкл фосфатного буфера рН 7,2 - 7,3, 100 мкл, обработанных трипсином эритроцитов барана, 100 мкл 100 ь-ного медицинского желатина и 100 мкл 250/-ного раствора глутарового альдегида, Перемешивают и инкубируют 30 мин при 37 С. Полученный диагностикум промывают 3 - 4 раза фосфатным буфером рН 7,2 - 7,3 и к осадку эритроцитов добавляют 3 мл 10 ь-ного растворабычьего сывороточного альбумина в щЫаС 1,Постановку РТПГА выполняли следующим образом,В начале исследования устанавливают количественное соотношение желатина и фибронектина, при котором наступает торможение реакции гемагглютинации, Для этой цели используют планшеты для иммунологических исследований отечественного производства, Неспецифическая сорбция и спонтанная гемагглютинация эритроцитов устраняется проведением реакции, в растворе 1 %-ного бычьего сывороточного апьбумина, приготовлзнного на М растворе хлорида натрия. Данный раствор альбумина используется для разведения желатина, С этой целью в восемь пробирок вносят по 1 мл раствора альбумина, Затем в первую пробирку приливают 1 мл 0,1",4-ного раствора желатина, перемешива от и 1 мл из первой пробирки переносят во вторую, перемешивают и 1 мл из второй пробирки переносят в третью и т.д, Таким образом, получают следующие концентрации желатина; 0,05%, 0,025 о , 0,0125%, 0,00625%, 0,003125%, 0,0015625 о , 0,00078125%, 0,00039 , В каждую ячейку планшета первого ряда слева направо вносят по 50 мкл 0,05%-ного раствора желатина; во второй ряд ячеек - 0,025 ораствора желатина; в третий - 0,0125 о -ный раствор желатина и тд. Затем в первую ячейку первого ряда добавляют 50 мкл раствора фибронектина с известной концентрацией (например - 625 мкг/мл) и после перемешивания 50 мкл из первой ячейки переносят во вторую и т.д. Из 11 ячейки 50 мкл выбрасывают. 12 ячейка служит контролем и йе содержит фибронектина. Аналогичным образом готовят ряд разведений фибронектина в остальных восьми рядах ячеек. Таким образом, концентрация желатина уменьшается в ряду сверху вниз, а содержание фибронектина снижается в каждом ряду слева направо В каждую ячейку, начиная с контрольной, т.е. справа налево, вносят по 25 мкл 1 %-ной взвеси эритроцитов барана (диагностикум). Тщательно перемешивают и оставляют на 2-3 часа при комнатной температуре, Образование кольца в виде венчика указывает на гемагглютинацию, а выпадение эритроцитов на дно ячейки в виде точки свидетельствует об отсутствии гемагглютинэции. В каждом ряду находят ячейку. где реакция гемагглютинации отрицательная и на основании данных концентраций желатина и 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5 е фибронектина вычисляют отношение желатин/фибронектин, Оно характеризует томинимальное соотношение концентрацийжелатина и фибронектина, при котором наступает полное торможение реакции гемагглютинации,Согласно полученным данным это соотношение равно 6,4 и зависит только от чистоты и источника желатина,Для определения содержания фибронектина в исследуемой жидкости выбирают, в зависимости от предполагаемого его количества, раствор желатина (например, 0,0125%-ный раствор) и вносят его по 50 мкл во все ячейки планшета. Затем в ячейку первого ряда добавляют 50 мкл исследуемой жидкости, перемешивают и методом переката слева направо отовят ряд разведений, 50 мкл из 11 ячейки выбрасывают; 12 ячейка служит контролем и содержит только раствор желатина. Во втором ряду ячеек готовят аналогичным образом разведение нового образца исследуемой жидкости, Таким образом, на одном планшете для иммунологических исследований проводят определение количества фибронектина в восьми образцах проб. Далее, начиная с контрольных ячеек, вносят по 25 мкл 1 - ной взвеси диагностикума, перемешивают и оставляют при комнатной температуре до завершения реакции торможения гемагглютинации (40-60 минут), Затем в каждом ряду находят ячейку начала торможения реакции гемагглютинации. Содержание фибронектина определяют по следующей формуле:содержание фибронектина = количество желатина 6,4 гдев знаменателе - полученный коэффициент соотношения желатин/фибронектин - 6,4;в числителе - количество желатина в ячейках ряда;А - разведение исследуемой пробы в ячейке начала торможение гемагглютинации;20 - коэффициент перевода данных на1 мл исследуемой пробы,При сравнительном определении содержания фибронектина в 5 образцах плазмы крови человека методом реакции торможения пассивной гемагглютинации и реакцией агрегации частиц латекса получены следующие результаты:1686370 Реакция агрегации частиц латексаРеакция торможения пассивно ииКоличество опытов 51+59 мкг/м 286+5,3 мкгl м Составитель П,БонарцевРедактор Л.Лашкова Техред М,Моргентал К орректор . учеряваяМ.К ВНИЗаказ 3595 ТиражИПИ Государственного комитета по изобретениям и открыти113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 ри ГКНТ. ССС Производственно-издательский комбинат "Патент" . У, .Г, г. жгород, ул.Гагарина, 101 Преимуществами предлагаемого способа определения содержания функционально активного фибронектина в биологических жидкостях по сравнению с прототипом являются:Высокая (в 10 раэ) чувствительность, что 5 позволяет определять содержание фибронектина в спинномоэговой и амниотической жидкостях, где его концентрация находится в пределах 50 мкг/мл, Введение в систему желатина исключает возможность неспеци фической агглютинации, Способ позволяет одновременно вести в идентичных условиях определение содержания фибронектина в 8 - 12 пробах, он менее трудоемок и не требует специальной аппаратуры, 15Формула изобретенияСпособ определения содержания фибронектина в биологических жидкостях путем внесения в исследуемую пробу 20 сенсибилиэированных желатином корпускулярных частиц сорбента с последующим определением количества фибронектина по титрам реакции агрегации частиц, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности эа счет определения содержания функционально активного фибронектина, в качестве частиц сорбента используют формалиниэированные эритроциты барана, при этом их сенсибилизируют путем предварительной трипсинизации и промывки с последующей инкубацией с желатином в присутствии глутарового альдегида в течение 30 мин при 37 С, далее реакцию ведут в среде, содержащей 1 объем 100-ных формалиниэированных зритроцитов барана, 1 объем 10-ного медицинского желатина, 1 объем 25-ного глутарового альдегида и 9 объемов фосфатного буфера, а количество функционально активного фибронектина определяют по титрам реакции торможения гемагглютинации.