Способ стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения протопластов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5.О 1673596 А 1 с 1) С 12 М 5/О Б ИЯ ТЕРИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТРАТОВ. ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИЯ ПРОТОПЛАСТОВ ие относится к биотехнолостерилизации ферментных спользуемых для получения ротопластов. Целью изобрея ускорение стерилизации трудоемкости. Способ состоерментные препараты стерирующим излучением Со в60 Р. 2 табл,кдя лд,.( .:Эт,г и А д,":о;.и;дяатическдя бри Наукова :,чака мощности экспозиц пределах и ется. ся следуюиом диапазон при эдданн ения эффект рения не ме мма- нной В ддн облучения дозе облуч ш 1 ости из пособ осуществля м обдзом По 1 г сухого фермента"РесГГпдзе", помещают в ценпузырьки и облучают ионизиргочениемСо на установке РХМ)1,0- 2,0 мР при мощности 12,0После сблучения фермент из пвых пу ырьков растворяют в О,сахароэы, которую также престерилизуют автоклавированиев течение 20 - 25 мин, Для гидроточных оболочек в суспензию рклеток наливают стерильныйраствор и инкубируют в термос28 С б - 16 ч. Осаждение иосуществляют с помощью центСпособ иллюстрируется гпримерами.Пример 1ния Со в дозах Изучают влияние об0,25 Р; 0,50 Р, 1,0 Р: луче,0 и ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ1 РИ ГКНТ СССР АЗТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Сидоров В,А. и др, Сомдизация пасленовых, Киев1985, с, 49-50,Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в области культуры тканей и клеток, генетики и селекции для получения качественных протопластов растений,В биотехнологии для получения качественных протопластов растений большое значение имеет сохранение высокой стерильности и активности ферментны препаратов, растворяющих клеточные оболочки растений, Основное требование, предъявляемое к стерильности, состоит в том, чтобы все выделенные протопласты, культивируемые на искусственной питательной среде, были не заражены инфекционной микрофлорой и имели шаровидную форму с равномерным распределением хлороплдстов.Цель изобретения - ускорение стерилизации при снижении трудоемкости,Способ состоит в том что при стерилизации ферментных препаратов на них воздействуют ионизирующим излучением Со60 в дозах от 1,0 до 2,0 м Р при мощности 12,0 - 18,0 Р/с.(54) СПОСОБ С НЫХ ПРЕПА ДЛЯ ПОЛУЧЕН (57) Изобретен гии и касаетс препаратов, и растительных тения являетс при снижении ит в том, что ф лизуют иониз 1 дозе 1,0 -2,0 м напримерциллиновыеующим излу 20 в дозах-18,0 Р/мин,енициллино 5 М растворедварительном при 1,0 атмлизации кледстительныхферментныйтате при 26 ротопластоврифу ги,ледующими3,0 мР при мощности 18,0 Р/с на степень стерилизации ферментного препарата "Ресинпаве", взятого в 1 -ной концентрации, и влияние стирилизации этого фермента на качественный и количественный выход изолированных протопластов из клеток каллусной ткани земляники сорта "Рубиновый кулон",Опыт ставят в трехкратной повторности.Ферментные растворы, облученные указанными дозами, предварительно ставили в термостат на 5 - 6 сут при 28 С для выявления степени стерильности, В качестве контроля служил ферментный препарат "Ресапаве", растворенный в 0,5 М растворе сахароэы, стерилизацию которого проводили фильтрованием через мембранные фильтры - МШроге.Действие ионизирующего излучения на стерилизацию ферментного препарата (мощность дозы 12,0-18,0 Р/с) приведено в табл. 1.Как показывают исследования, доза облучения ферментного препарата 0,25 и 0,50 мР не приводит к желаемому результату, так как раствор на 5 - 6 - й день покрывается плесенью. Ферментные растворы, облученные дозами 1,0; 2,0 Р и 3,0 мР, являются стерильными и их используют в дальнейших исследованиях по выделению изолированных протопластов земляники.Наиболее оптимальной дозой облучения, которая лучше всего стерилизует ферментный препарат и сохраняет его активность, является доза 1,0 мР (см. табл. 1),Плотность жизнеспособных протопластов, выделенных при использовании ферментного раствора, облученного дозой 1,0 мР, составляет 1,5 10 п/мл. 5 10 15 20 25 30 35 40 Ферментные растворы, полученные от облучения фермента дозой 2,0 мР, приводят к снижению числа жизнеспособных протопластов и гибели значительной части протопластов, выделенных иэ клеток каллусной и листовой ткани земляники,Ферментные растворы, полученные от облучения фермента дозой 3,0 мР, полностью теряют свою активность и не пригодны для растворения клеточных оболочек.П р и м е р 2. Осуществляют аналогично примеру 1, только действие простерилизованных ферментных препаратов исследуют на тканях сливы,Результаты представлены в табл. 1.П р и м е р ы 3 - 5. Аналогично примерам 1-2 исследуют действие препаратов на получение протопластов из тканей других плодовых культур,Результаты представлены в табл. 2, Предлагаемый способ стерилизации фрментных препаратов позволяет не применять импортные мембранные фильтры для получения растительных протопластов, что сущетвенно ускоряет рабочий процесс и сокращает затраты труда и денежных средств,Формула изобретения Способ стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения протопластов, включающий воздействие на них фактором, обеспечивающим высокий уровень стерильности при сохранении их активности, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения стерилизации при снижении трудоемкости, на ферментные препараты воздействуют ионизирующим излучением боСо в дозе 1,0-2,0 мР при времени инкубации 16 ч.1673596 Таблица 1 Действие ионизирующего излучения на стерилизацию ферментного препарата Мощность дозы 12,0 р/ик - 1 Е,О р/сек Источники выделения протопластов Доза, мР Характеристика препарата,плотность протопластов взависимости от дозы облучения, п/мл 1,2 10 Клетки каллусной тканиэемпяники "Рубиновый кулон" КонтрольМ 1111 роге 0,25 Нестерильный Нестерильный 1,5 100,5 1,0 20 3,0 Летальный исход 0,1 10 Клетки листовой ткани сливы сорта Ренклод колхозный КонтрольМ 111 дроге Нестерильный 025 Нестерильный 0,7 10 0,2 10 0,5 2,0 3,0 Летальный исход П р и м е ч а н и е. Фермент - "Ресйпаяе" 17,-ный раствор; осмотический стабилизатор - сахароза, 5,0 М; время инкубации 16 ч,Таблица 2 ОсмотическийстабиИсточник выделения протопластов Лоэв облучения, ИР Характеристика препвратв,плотность протоллвстов евввиснмости от дозы облуЗяя Фермента и концентрв ция Х Времяинкубвции ч тор енияестери8,О ,О Се 1 ва 1 а,ОХ Клетки каллус ной ткани грувв сорта "Коперечка" Сахарова5,0 И 0,2 0,5 1,0 2,0 Э,О 0,2 05 1,0 2,0 3,0 Нестерильныйе1, 1 10О, 73 1 ОЛетальный и ход Нестерильный Клетки листо вой ткани см родины сортаПамять Мичу ринан Пектофое- Л-Мвннит 16тидин, 0,4 М 3,4 1 О2,4 1 ОЛетальный исход