Способ получения эритропоэтина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК А 1 16519 51)5 А 61 К 37/ ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТКРЫТИЯМ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН о 5 овец,АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Научно - исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РСФСР(56) Заа. ВО., 1 осйе С. Ятомез оп ауЬгороет 1 п1 Ргобцс 11 оп оФ Ы 9 Ь - 111 ег разаа 1 и з оеср. - Ргас.Яос. Ехр, Во 1. Мед, 1959, 101, р.686 - 688.) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОПОЭНА Изобретение относится к биотехнолои, а именно к получению гормональных репаратов,Целью изобретения является повышение выхода эритропоэтина,П р и м е р 1. У овцы, зараженной анаплазмами (Апаразаа очз) в период острого течения болезни, когда количество эритроцитов, пораженных анаплазмами составил 10 ф, используют кровь для заражения свободных от кровепаразитов,Опытному предварительно спленэктомированному животному вводят внутрибрюшинно 20 мл инфицированной крови сразу же после ее отбора. Непосредственно перед заражением число эритроцитов у опытного животного составляет 9,8 млн/мкл, количество гемоглобина и уровень эритропозтина 153 г/л и 0,03 ЕД/мл соответственно.Через 15 дней после заражения берут пробы крови и определяют число эритроцитов, количество гемоглобина и уровень эритропо 2(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению гормональных препаратов. Целью изобретения является повышение выхода эритропоэтина, Поставленная цель достигается тем, что в качестве стимулятора образования эритропоэтина используется кровь животных, зараженных анаплазмами. При падении концентрации гемоглобина ниже 19,02 г/л после стимуляции у животных отбирают кровь, выделяют плазму, содержащую высокую концентрацию эритропоэтина, Полученный препарат не требует очистки и может быть использован при культивировании клеток и для получения эритропоэтина. 1 табл. этина, которые характеризуются следующими показателями: число эритроци-. тов 3,9 млн - мкл; количество гемоглобина 43 г/л; уровень эритропоэтина 0,3 ЕД/мл.В течение последующих 4 дней контролируют соответствующие показатели, которые на 19 день после заражения составили: число эритроцитов 1,55 млн/мкл; количество гемоглобина 16,3 г/л; уровень эритропоэтина 1,5 ЕД/мл, т,е. при падении количества гемоглобина до 16,3 г/л уровень эритропоэтина увеличился до 1,5 ЕД/мл по сравнению с 0,03 ЕД/мл до опыта.П р и м е р 2, У опытного животного, свободного от кровепаразитов и предварительно спленэктомированного, определяли общее состояние. окраску видимых слизистых оболочек и коньюктивы, температуру, пульс, состояние сердечной деятельности, число эритроцитов, количество гемоглобина и уровень эритропоэтина, последние пока-. затели контролируют в течени б дней, начиная с 12 дня после заражения, 1651909Перед заражением число эритроцитов составило 8,8 млн/мкл, количество гемоглобина и уровень эритропоэтина 153 г/л и 0,04 ЕД/мл соответственно,Инфицированную кровь, полученную от барана, больного анаплазмозом, в дозе 40 мл сразу же вводили внутрибрюшинно опытному животному.На 18 день после заражения показатели крови следующие: число эритроцитов 1,5 мл н/мкл; количетво гемоглобина 16 г/л;. уровень эритропоэтина 1,5 ЕД/мл.П р и м е р 3. На группе овец, свободных от кровепаразитов и предварительно спленэктомированных, изучена динамика изменения показателей крови в зависимости от продолжительности периода после заражения.Всех животных заразили внутрибрюшинно введением 40 мл крови, полученной от больного анаплазмозом барана. Основные показатели крови - количество зритроцитов, гемоглобина и уровень эритропоэтина определяли до заражения, через 12, 15, 18 и 19 дней после заражения.Результаты представлены в таблице.Как видно иэ данных таблицы, на 18 - 19 день отмечалось резкое падение количества гемоглобина при одновременном повышении уровня эритропоэтина.При падении концентрации гемоглоби-. на до значения ниже 19,0 г/л животных обеСкровливали, из полученной крови после центрифугирования при 3000 об/мин, в течение 30 мин отделяли плазму, которая в замороженном виде может храниться длительныйй срок(при температуре -20 С в течение 4-6 мес,).Для определения эритропоэтической активности использовали полицитемических постгипоксических мышей-самок линии Г 1 (СВАхС 57) В 1. Полицитемию вызывали содержанием животных в барокамере при давлении 0,45 атм по 18 - 20 ч в сутки в течение 14 - 16 сут. Перед началом гипоксии мышам вводили внутримышечно 2 мг препарата железа "Феррум - Лек". На 4-5 сут после прекращения гипоксического воздействия вводили подкожно по 1 мл испытуемой сыворотки (плазмы) на 6 день - 18,5 кБК(0,4 мл) раствора цитрата железа, меченного Ее в хвостовую вену. Эритропоэтическую активностьплазмы оценивали через 48 ч по включениюГе в эритроциты по числу ретикулоцитов,которые подсчитывали в сухих мазках, окра 5 шенных бриллиант-крезил-блау. Для подсвета включения Ге в эритроциты брали0,5 мл крови, Подсчет производили на гамма-счетчике фирмы ЛКБ (Швеция). В качестве стандарта использовали две пробы (0,4 мл10 с активностью 18,5 кБК) с раствором цитратажелеза, меченного Ее. Процент включенияЕе в эритроциты рассчитывали по формулчисло имп./проба х 7 х масса мыши хГечисло имп,стандарта15 где число имп./проба - импульсы в минутув 0,5 мл крови; 7 - объем крови у полицитемических мышей.Активность эритропоэтина в испытуемойпробе перессчитывали в мЕд по доз-реакци 20 онной кривой, построенной по лабораторному стандарту эритропоэтина, эритропоэтинадля данной линии мышей.Воспроизводимость результатов в эксперименте контроливалась введением физио 25 логического раствора и определенной дозы(0,4 ЕД) стандартного препарата зритропоэтина.Таким образом, предлагаемый способоткрывает дешевый, доступный источник30 сырья, Преимуществом эритропоэтическойактивности является то, что не содержиттоксических соединений, а выделенный изнее эритропоэтин может быть использованпри культивировани клеток без высокой сте 35 пени очистки, т.е. примеси плазменных бел:ков не оказывают отрицательного действия," в результате добавления цельной сыворотки в качестве питательной среды,40 Формула изобретенияСпособ получения эритропоэтина, включающий введение индуктора образования эритропоэтина. овцам с последующим отбором крови, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с 45 целью повышения выхода эритропоэтина, вкачестве индуктора образования эритропоэтина используют кровь овец, зараженных анаплазмами, а отбор крови осуществляют после снижения концентрации гемоглобина 50 до значения 19,0 г/л.1651909 Динамика изменения показателей крови оставитель А.Федоровехред М.Моргентал орректор Э.Лончаков Редакт ереда Заказ 1730 Тираж 462 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва. Ж, Раушская наб., 4/5 изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 10