Способ отбора препаратов микробных аллергенов для иммунодиагностики

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦЮЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК ЯО 16229 А 1(51)5 С 01 Б 33 53 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯМ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР(71) Горьковский медицинский институт им.С.М.Кирова(54) СПОСОБ ОТБОРА ПРЕПАРАТОВ МИКРОБЯ 4 Х АЛЛЕРГЕНОВ ДЛЯ ИММУНОДИАГНОСТИКИ(57) Иаобретение относится к медицине, а именно к стандартизации коммерИзобретение относится к медицине,в частности к стандартизации коммерческих аллергенов.Цель изобретения - повышение точности способа.Предлагаемый способ осуществляютследующим образом,Для исследования берут коммерческий аллерген или экспериментальныепроизводственные серии аллергенов,Лимфоциты выделяют из периферической крови взрослых здорова;х донорови новорожденных (пуповинная кровь)на гр,диенте плотности фиколл-верографина (1,077 кг/м ) центрифугиронанием при 3008 в течение 30 мин,дважды отмывают и ресуспендируют всреде 199 в количестве 3 млн.клетокна 1 мл.".оноциты удаляют инкубншейлимфоцитов в пластиковой посуде в теческих препаратов, Цель изобретенияповышение точности способа. У взрослых доноров и из пуповичной крови выделяют лимфоциты, которые инкубируют с аллергенами, центрифугируют и супернатянтамиобрабатывают нейтрофилы, выявляют ихактивность в реакции восстановлениянитросинего тетраэолия, вычисляют разницу в активности опытных проб и контроля без аллергена и при показателяхразницы у взрослых выше 20 и отсутствии ее у новорожденных препарат отбирают для иммунодиагностики, В сравнении с известным способом точность отбора увеличивается на 357. чение 60 мин при 37 С. Жизнеспособность клеток определяют по трипановому тесту (должно быть не менее 94 Е жизне способных клеток).Лимфоциты взрослых доноров и лимфоцнты нов рожденных обрабатывают аллергеном в дозе 10 мкг/мл, инкубируя в термостате при 37 ОС 40 мин, затем их отмывают от несвязавшегося аллергена. Далее лимфоциты взвешивают в среде 199 и культивируют в течение 72 ч при 37 С (опытные пробы),В контрольных пробах лимфоциты культивируют беэ обработки аллергеном в аналогичных условиях. Выделяют супернатант центрифугированием при 600 х 8 в течение 20 мин. В опытных пробах смешивают О, мп цельной крови от взрослых доноров и по 0,025 мл 0,27,-нсго раствора нитроси 1627993н его тетразолия и супернатанта, полученного после культивирования клеток с аллергеиом, В контрольных пробах используют супернатант, полученный после культивирования без аллергенов.Указанные компоненты осторожноперемешивают, затем инкубируют пробы в течение 30 мин при 37 С. В дальнейшем иэ содержимого пробирок илилунок готовят мазки, высушивают, фиксируют в течение 5 мин в метаноле,ядра докрашивают 7-10 мин 27.-ным водным раствором метнлового зеленого,промывают и после высушивания микро -скопируют под иммерсией, Просматривают 100 клеток, результат выражают ввиде процента нейтрофилов, содержащихпри стимуляции грубодисперсные отложения диформазяна (восстановленнаяМрма нитросинего тетразолия).Критерием стандартности исследуемых препаратов, а следовательно, нх пригодности служат следующие показатели: при 25разнице в активности с супернатантаии (опыт-контроль) лимфоцитов взрослых выше 20 и отсутствии ее с супернатантами лимфоцитов новорожденныхпрепарат считают стандартным. ЗОП р и и е р 1, Коммерческий аллерген золотистого стафилококка (серия12, У ОКВ 471).Димфоциты выделяют ча градиентеплотности фиколл-верографина(1,077 кг/м). Концентрация лимфоцнтов 3 млн.клеток на 1 мл, Затем смешиваютравные объемы (по 1 мп) взвеси лимфоцитов и препарата аллергена(10 мкг/мл) и выдерживают 40 мин прн37 С (опыт). Отмывают от несвяэавшегося аллергена, лимфоциты взвешиваютв среде 199 и культивируют 72 ч при37 оС, В контроле лимфоциты культивируют без добавления аллергена в ана логичных условиях, Затем смешивают0,1 мл цельной крови и по 0,025 млтестируемого препарата (супернатанткультур) и 0,2 Ж-ного раствора ннтросинего тетраэолия, Паряллельно ставят опыт с супернатантами лимфоцитов взрослых и новорожденных. В контроле -супернатанты лимфоцитов вэрогльк иноворожденных, полученные из культур, не обработанных аллергеном. Ингредиенты реакции осторожно перемешивают и55 термостатируит в, течение 30 мин при 37 С, Готовят мазки, высушивают,фиксируют, докрашивают их раствором метилового зеленого, микроскопируют.Подсчитывают 100 нейтрофилов, определяя процент стимулированных клеток,В опыте с супернатантом лимфоцитов взрослых доноров количество стимулированных клеток составляет 50, вконтроле с супернатантом лимфоцитоввзрослых доноров - 5. Разница междуопытом н контролем - 35. В опыте ссупернатантом лимфоцитов новорожденных количество этих клеток составляет 18, в контроле с супернятантомлнмфоцитов.новорожденных - 8. Разни. ца между опытом и контролем - О. Препарат в соответствии с предлагяемымспособом считают стандартным.П р и м е р 2. Маточный аллергенмукор пуэилус на одной из стадийтехнологического получения (серия 1,белок по Лоурн 0,750 мкг/мл),Порядок проведения исследованияаналогичен описанному в примере 1,Разница между опытом н контролемс супернатантами лимфоцитов взрослыхдоноров составляет 1 7, а разница между опытом н контролем с супернатантами лнмфоцитов новорожденных равняется 2, Препарат не являлся стандартным,С помощью предлагаемого способаобеспечивается повьппение точностина 35/ (по известному способу выбраковывают 547 препаратов аллергена,а с помощью предлагаемого - только5 Е).Кроме этого, исключается необходимость введения препарата человекупри оценке его специфической активности, Это особенно важно для оценкикачества препаратов на разных стадияхтехнологического процесса, так каквведение таких препаратов нежелательно, Пр: применении предлагаемого способа можно ограничиться взятием донорской крови.Формула изобретенияСпособ отбора препаратов микробных аллергенов для иммунодиагностики, включающий забор крови от взрослых доноров, вьщеление лимфоцитов, инкубацню нх с аллергеном, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повьппения точности способа, дополнительно производят забор крови из пуповинной кроьн новорожденных, выделяют лимфоцнты, инкубнруют их с аллергеном вСоставитель В,ЛитовченкоТехред Л,ОлийныкКорректор А.Осауленко Редактор А,Огар Заказ 338 Тираж 407 Подписное 3 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рауаская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 5 162799 дозе 8-10 мкг/ип, далее обе пробы центрифугируют н супернатантами обрабатывают нейтрофилы крови взрослого донора, выявляют их активность н реакции восстановления нитросинего тетра 3 эолия, вычисляют разинцу между 3Фактивностью нейтрофилов в пробах и контроле беэ аллергена и пди пока эателях разницы показателя у взрослых выше 20 и отсутствии ее у новорожденных препарат отбирают для им" муноднагностикн.