Способ определения стероидов в насекомых

(21) 4469678 (22) 01.08.8 (46) 23,12.9 (71) Всесоюз ский институ защиты расте (72) Л.С.Кей (53) 632.937 (56) ТЬотдряо Гог ййе хяо 1 оГ яйего"1 я ЬдрЫя, 1980 М 47я к сельск методам ра для массоиспользу повышение ьных сред насекомых да. Цель - а счет уск особ включ во мь го разведени х для биомет эффективности цесса. Новый с цию пробы насе телей: хлорофо орения прокстрак створи ает омого с ь м - метан ь л или хлори- :1), обработ к метилен метанол Изо сельск именно ных ср насеко ческой растенЦел шение защиты сельс дни а ю изобретенид 4 ективности тся пов т ускор я а я процесса, Приме моли обрабат 1, 1ют 15 яиц зерно мп смеси хлОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТРИ ГКНТ СССР т биологических методовнийсер и В.НаРетунский.а.оп апй ЫепйЫсахопп Ыяеся апй А 18 ае,а ча 15 а 9 а ра 719 а ретение относится к областиго и лесного хозяйства, ак методам разработки питатд для массового разведениямых, используемых для биолокохозяйственны 2ку экстракта водой, а после расслоения Фаз выделение целевых фракций методом твердофазной экстракции. Выделение экдистероидов из верхней фазы производят путем твердофазной экстракции на силикагеле с химически привитыми октадецилсилановыми группами последовательной обработкой экстрагента водой, 25-и 50%-ным раствором метанола в воде. Выделение эфиров стеринов и свободных стеринов путем твердофазной экстракции на силикагеле проводят в 2 этапа. На первом через твердый экстрагент пропускают нижнюю Фазу, растворитель упаривают, пробу растворяют в гексане. На втором твердый экстрагент последовательно обрабатывают раствором гексана, 1",8-и 15%-ным раствором эфира в гексане. Изобретение позволяет одновременно в одной пробе определять 3 класса стероидов; экдистероиды, стерины и их сложные эфиры, одновременно обеспечивается не менее 80%-ное выделение стероидов, 2 табл.тый метилен - метанол (2: 1), измельчают с помощью ручного стеклянногогомогенизатора, и экстракцию проводятв течение суток при комнатной температуре. Экстракт Фильтруют через бумажный (или стеклянный) Фильтр в делительную воронку и добавляют 4 млНО. После встряхивания смеси происходит расслоение смеси на верхнююи нижнюю фазы. Нижнюю Фазу отделяют.Верхнюю Фазу 2 раза обрабатываютхлористым метиленом (по 5 мл), кото 64114рый затем добавляют к нижней фазе.После этого нижнюю Фазу 2 раза обрабатываеот водой (пс 4 кл), присоединяя водный раствор к верхней фазе,ПОсле второй обработки водой нижнююФазу Фильтруют через бумажный фильтрс безводным сульфатом, натрияИз верхней фазы, содержащей экдисероидье, упаривают метанол на ротор- О.нем испарителе при 40-45 С, из водиего остатка производят выделениестероидов путем твердофазной экстракцйи. Для этого водный раствор пропускают через 0,5 г силикагеля с химичзски привитыми октадецилсилановымигруппами, затем твердый экстрагентобрабатывают водой (5 мл), 25 в и5)%-ньеми растворами метанола в воде(1 по 5 мл), собирая последнюю Фракцию 20дея аналитических определений.Из нижней фазы производят выделение стеринов и их эфиров путем твер -дофазной экстракции на силикагепе.Деея этого на первом этапе нижнюю Фазу 5пеопускаеот через твердый экстрагент(0,5 г), при этом ца нем остаютсяполярные липиды. Полученный растворееейтрапьееьех пипидов упаривают на роторном испарителе при 25"28 С, оста-.ток растворяют в 4-5 мл гексана ипропускают через новую порцию экстрагента (0,5 г). Далее поспедоватепь -цо обрабатывают экстрагент 2 .мп гексана, 5 мл 1%-ного раствора эФира ве 1 ексане ,фракция эфиров стеринов),10 мл 8%-ного раствора эфира в Гекс- е (фракция триггеееп ридов и свободе- ех кислот отбрасывается) 10 мп15%-ного раствора эфира в гексанеФракция .свободньех стерннов): Вьеде -г 1 еееееьее фракции .еспользуеое д,-е:. гров -дения аналитических о-редепен:иП - и и е р 2. 2 г бабочек зерно.вой моли о Гр аб ать:в еют 20 мл смесихлороформ -. метанол (2;1; и далее выполняют последовательность операе;ийкак в примере 1,Результаты определений по приее-.рам 1 и 2 представленье в табл 1,П р и м е р е (оееенка правильности.:ередлагаемого способа). Цтея оценкиправильности способа подготовкипробы используют ьеодльцую смесь,в которую входят прецставите 55пи классов экдистеронцов, эфиров стеринов и свободных стеринов,а также мешающие определению вещества (углеводороды тригпиц ряды, свободе 4 е 4 е жеерцые кис.еоте у фосфолиГеиде с Смеь наносят на субстрат из насекомых, из которых удалены пипиды, в том числе и стероиды (субстрат - яйца зерновой моли, обработанные избытком (дваждье) смеси хлороформ-метацоп)На 2 г субстрата наносят,мкг: хо:еестерипбензоат (эфир старица) 105, эргостериц (свободный стерин) 180, экдистерон (экдистероид) 40, 8-додецен (углеводород) 2000, оливковое масло - 80% триолеина (триглицериды) 28000, олеиновая кислота (жирная кислота) 28000, лецитин (фосфолипид ) в 2 мп хлористого метилена, 5000. Черезч производят экстракцию и выделение целевых фракций Конечцое определение стероидов производят спектрофотометрическим методом при указанных значениях длин волн на основе построения калибровочного граФика Максимум поглощения дпя холестерилбееезоата составляет 228 нм, эргостери:;а 282 нм, экдистерона 242 нм, Количество мешающих веществ более, чем в 150 раз превышает количество определяемых стероидов, причем мешающие вещества сами обладают значительным поглощением в указанных областях Уф-спектра. 1 езульт .т: подготовки проб и анализа представлены в табл.2 (сеиспо повторностей п)Предлагаемый способ позволяет одновременно в одной пробе определять три класса стероидов: экдистероиды, стерины, я.; сложе.ые: фиры, при этом обеспечивае гся не менее, чем 80%-ное выделение стероидовФормула изобретенияСпособ определения стероидов в насекомых, включающий экстракцию стероеедсв сМес;ю растворителей. последующее выделение еепевых фракций и Дец.идбКацию стероивов с помощью спехтроф гоьее";ра, о т л и ч а ю щ и йс я тем что,. с целью повышения эффективности за счет ускорения процесса. экстракцию стероидов проводят месью хлороформ - метанол или хлористый метипен - метанол при соотношении компоентов 2;1, выделение целевых Фракций проводят после обработки экстракта водой и расслоееее;я фаз методом твердофазной экстракции, причем выделение экдистероеедов изв рхцеи фазы проводят путем твер4774 6чем первоначально через твердый экстрагент пропускают нижнюю фазу, растворитель упаривают и остаток растворяют в гексане а затем новую порацию экстрагента последовательно обрабатывают гексановым экстрактом исмесью эфира с гексаном с увеличивающимся содержанием эфира от 1 до 157.10 в гек".ане. Таблица Пример Нетод и результаты определения стероидов Объект нсслецоЭхстрагент ванна Спехтрофотбметрнческоеопределение флуорнметрнческоеопределекие Весовое азакндкостиая хро матогряфия распре- лелекие видко- хромая 24 728 эфирыстепинсвободстерккы 2 йца зерновой 34 50 Общ хан Системс растворктелейсацетоннт" рнл - водатифицировакь эФирах стер меетипе ктакал ( овзВ/г ы стеерик эфир рина нов:холестерингитостеринДт-холестеринсвободные стерккыхолестеринэргостеринкампестеринситостерикЧлено, С/холестерин 575кампестеркн 45ситостерик 107 Ь 6 свободныестернны53,1 Иденвакизон-экдикдистеов 3 /г . 5,0 с/г Иденти(всвзсров акы св экднзон н экдистеабочки зерно- Хлороформ - ме я 15 ой моли талал (21) 2,40 ентифнци рованыв эфирах стерннов:холестеринкампестеринстигмастеркнситастерикв свободных стрннахсхолестеринэргостерннстигмастерикситостермн Эфиры сте в 42,0вободпыетернкы 185 1/г абд Экстрагент естерклбекзоат Эргосте староПроцент Вх Задановыходаикг коВыделес мхг ко,Хлоркстый мети лек - метанол (21) 80 14 05 94 89,5 112 05 92 87,6 10,7 4 4 7,5 Хлороформ " меакол (2;) 98,0 6,4 8 2 40 к и е ч а к н е. Вх - относительное ста иое отклонение Составитель В.Горбатовский едактор Н,Бобкова Техред М,дидык Коектор Л.Беск 50тЖ, Рауш аказ 3941НИИПИ Госг а по изобретени Подписное м и открытиям при ГЕНТ СС наб., д. 4/5ка Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород гарина, 101 дофазной экстракд 1 и ыа силикагеле схимически привитыми октадедилсилановыми группами последовательной промывкой вердого экстрагента водой,25- и 50%-ным раствором метанола вводе, а выделение сложных эфировстеринов и свободных стеринов проводят путем последовательной твердофазной экстракдии на силикагеле, при -Общее сапер- Для зкдикаике энди- стерона,