Ингибитор протеолиза

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 9) ( 51) 5 К 37/6 НИЕ И ДЕТЕЛЬСТ К АВТОРСКОМУ НГИБИТОР ПРзобретениеожет бытьэкспериме(5 спользовано в тальной харди о и о с т ч ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ П(НТ СССР(71) Хомский медицинский институ(56) Вопросы медицинской химии,1980, Р 6, с. 832-836. ОТЕОЛИЗА относится к медициИзобретение относится к медицине,а конкретно к медицинской биохимии,может быть использовано в биохимии,экспериментальной кардиологии, терапии, и касается средств, ингибирующихпротеолитические Ферменты.Цель изобретения - выявление средтва,ингибирующего протеолиз, пепидной природы, получаемого синтетиеским путем.П р и м е р 1. В работе используютследующие препараты: трипсин (Спофа,ЧССР), химотрипсин и андекалин (отечественные препараты), калликреинплазмы крови человека, выделенный иочищенный по известному методу; брадикинин-триацетат (Реанал, ВНР),контрикал (ЧЕВ, ГДР). Для определенияактивности протеиназ используют в качестве субстрата И-бензоил.-аргининэтиловый эфир (БАЭЭ, Реанал, ВНР).Молекулярный вес каждого ферментаопределяют гель-хроматограФией на сефадексе-100. терапии. Цель изобретения - выявление средства, ингибирующего протеолиз, пептидной природы, получаемогосинтетическим путем. Для ингибирования протеолиза в экспериментальныхисследованиях используют брадикинин.Изобретение позволяет выявить препарат пептидной природы, конкурентноингибирующий активность калликреина,обладающий способностью подавлятьпротеолитические процессы при экспериментальном инфаркте миокарда.3 табл. Взаимодеиствие брадикинина и контрикала с протеиназами изучают с помощью кинетического анализа, Ферменты инкубируют с ингибитором в течение 15 мин, используя следующие концентрации: растворов ферментов (10 10 М), брадикинина (10 -10 М), контрикала ( 10-10 ЗМ), БАЭЭ (2 х 10 1 х 10 М). Затем измеряют БАЭЭ - эстеразную активность Фермента в присут - ствии и отсутствии ингибитора, строят графики в координатах Михаэлиса и Лайнуивера-Бэрка, определяют К и Ч. Для определения эффективноймаксдозы брадикинина и контрикала для трипсина и химотрипсина определяют 1 , т.е. концентрацию ингибитора, снижающую скорость БАЭЭ - эстеразнои реакции на 507. На основании этих данных рассчитана 1 -доза: для бра 5 Ъдикинина - 1 мкМ и контрикала 100 мкМ. Таким образом, эффективная концентрация брадикинина в качестве ингибитора трипсина и химотрипсинав 100 раз меньше, чем контрикала.Брадикинин конкурентно ингибировал БАЭЭ-эстеразную активность анде- калина, калликрейна плазмы крови че" ловека с К 5,2 х 10 М; 2,4 х 10 М соответственно, и являлся неконкурентным ингибитором для трипсина и химотрипсина, снижая Ч, на 50%. Контрикал, взаимодействуя с трипси ном, химотрипсином, андекалином и калликреином плазмы, обладал свойствами неконкурентного ингибитора.Такп;м образом, орадикинин можно использовать как специфический конкурентный ингибитор калликреина плазмы и тканей в биохимических исследованиях при изучении взаимодействия активного центра протеиназ с эффекторами. 20П р и м е р 2Для выявления характера действия брадикицина в организме изучают активность.калликреина плазмы крови мышей и его предшественника при внутривенном введении пре парата.Брадикинин триацетат, приготовленный на физиологическом растворе, вводят в хвостовую вену мьппам линииВА 1 В/с. Доза препарата 1 мг/кг массы 30пересчитана по эффективной дозе, найденной в предыдущей серии. Контрольным животным вводили Физиологическийраствор . Через 2, 6 ч, 1,3, 7 сут . послевведения брадикинина определяют акЭ 5тивность калликреина и калликреиногена плазмы крови ььпдей, Результатыэтого исследования представлены втабл. 1.Снижение активности калликреиноге 0на и калликреина плазмы крови мышейнаблюдалось в течение 6 ч после введения брадикинина, Наиболее значительное торможение активности калликреина (на 47%) происходило через 4 ч, 45активность калликреиногена, предшественника фермента, подавлена на 5667% через 1-6 чпосле ийъекции препарата мьпдам.Таким образом, введение брадикинина мышам линии ВА 1 В/с также как в условиях п чСго вызывает подавление активности калликреина и калликреиногена плазмы крови. Более значительный эффект характерен для пред- .35 шественника фермента.П р и м е р 3. В опытах используют беспородных белых крыс самцов массой 150-180 г. Брадикинин-триацетат (ВНР) вводят в хвостовую вену в дозе1 мг/кг массы, контрольным животнымвводили физиологический раствор. Через 2,6 ч, 1,3,7 сут. после введениябрадикинина определяют активностькатепсина 0 печени и сердца, Свободную и общую активность фермента определяют в отсутствии и присутствииО, 1%-ного раствора тритора Хсоответственно по расщеплению гемоглобина и выражают в нмоль тирозина/мгбелка в 1.мин по методу Аксона.В условиях дп чСго добавляют1 мкМ брадикинина в среду инкубациигомогенатов печени и сердца в процессе определения активности катепсина О. Данные этих опытов представлены в табл. 2,При инкубации с брадикинином более значительно снижалась активностькатепсина Р сердца, чем печени: свободная - на 40 и 29%, общая - на 32и 25% соответственно.В результате изучения активностикатепсина Р печени и сердца в условиях п чача была .показано, что привнутривенном введении брадикининакрысам происходило уменьшение активности фермента сердца и печени на 2040% по сравнению с контролем в течение 24.ч, а затем наблюдалось восстановление. Следует отметить, что болеесущественное подавление активностикатепсина П брадикинином характернодля сердечной мьпдцы.П р и м е р 4. Инфаркт миокардамоделируют путем перевязки левой коронарной артерии. Брадикинин и контрикал вводят через 1 ч после операри внутривенно в дозах 1 мг/кг.и7500 ед/кг массы соответственно. Через 1 сут, после операции крыс декапитируют, извлекают сердце и печень,готовят гомагенаты в отношении 1:10на охлажденном 0,25 М растворе сахарозы (рН 7,4). В гомогенатах определяют общую и свободную активность катепсина Р,Результат опытов по изучению активности катепсина 0 в органах привведении брадикинина и контрикалана фоне инфаркта миокарда представлены в табл. 3, При инфаркте миокардау крыс происходят значительные изменения активности катепсина Р в ткани сердца., Через 1 сут. после пере"вязки коронарной артерии наблюдалось увеличение свободной активности15813 О Калликреин Калликреиноген Срок послевведения мЕ/мл плазмы Контроль (9)1 ч (10) 4 ч (8) 6 ч (10) 1 сут.(8) 3 сут.(8) 7 сут.(9)309, 1+18, 2260,7 й 33 в 2163,6+27,31 ь236,3+12,1358, 1+21,5283,6+31,3301,8+36,5 1754,4+45,0 678,6 Ф 21,5+ 5 70 э 8+43,6 эс 763 э 5 Т 20 э 1 14 03 э 5148 э 4 эт 1729 э 1 й 132 э 91652,6+88,4В скобках указано число опытов.- Достоверные изменения. вТаблица 2 Контроль Брадикинин Свободная Общая Свободная ОбщаяПечень 7, 19 фОэ 61Р (0,054 э 82+Оэ 32Р (Оэ 05 2, 97+0, 39 4 э 44 Ф Оэ 45 9 в 62+Ор 88 7 э 06 Ф Оэ 56 2, 11+0, 28 Р ) 0,05 2 э 6410 э 30 Р ( 0,05 Сердце П р и м е ч а н и е. Представлены данные 6 опытов. Таблицв 3 ИнФаркт Рмиокарда яконтрикал ИФаркт Рмиокярла + браликнннн Интактные ИнФвркт Р миокарла Своболная 4,4420,35 7)56+0, 36 О, 001 Серлце 7,0620,36 10,02 М 1,23 с 0,001 Общая 2,7720,60 э 0,5 3,6250 29 0,5 Свободная 2,9750,49 3,38 50,86 0,5 Печень Общая 8,0860,58 Э 0,05 9,620,56 9,7860,60 70,5 8,521,65 эО 1 П р и и е ч а н и е. В каялоР группе испольэовало по 10 крыс,катепсина 0 в 1,7 раза, а общей - в1,4 раза. В печени, не, подвергавшейся повреждению, отмечено несущественное возрастание свободной активности фермента. Брадикинин и контрикал, введенные через 1 ч после скклюзии венечной артерии, подавляют свободную активность катепсина 17 сердца на 49 и 417, а общую активность на 30 и 373 соответственно. В печени при введении брадикинина наблюдалось снижение активности катепсина П; свободной - на 197., общей - на 163. При введении контрикала происходит несущественное увеличение свободной и снижение общей активности фермента - на 173.Следовательно, брадикинин, также как контрикал, обладает отчетливым 21 6ингибирующим действием на протеолитическую активность катепсина П при инфаркте миокарда у крыс, особеннов поврежденной ткани сердца,Изобретение позволяет выявить препарат пептидной природы, конкурентноингибирующий активность калликреина,обладающий свойствами ингибитора протеолиза при зксериментальном инфаркте миокарда, Эффективная концентрация брадикинина в 100 раз меньше,чем контрикала, используемого в терапии, кардиологии для ингибированияпротеолиза. Формула изобретенияПрименение брадикинина в качестве ингибитора протеолнза для экспериментальных исследований.Т а блица 1 3,842069 0,001 4,48+ 1,35 40, 05 7,00+1,00 С 0,0 6,2821,24 0,001