Способ определения активности аргиназы мозга в сыворотке крови

(19) (11 С 01 М 33/4 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН У 28медицинскинова и Научтитут невро инс исии Т.С.ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИАРГИНАЗЫ МОЗГА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа при одновременной возможности длительногосохранения образцов. После обработкиформальдагидом сыворотку крови нано(сят на фильтровальную бумагу, высушивают, промывают раствором хлористого калия и вновь высушивают. Обработанную опытную полоску с пробой иконтрольную полоску погружают в рас"твор аргинина и в эти же пробиркивносят рабочий раствор для определения мочевины. Пробы ставят в кипящуюводяную баню на 12 мин. В контрольныеобразцы аргинин вносят на 2-й минутепребывания их в бане. Затем пробыохлаждают и измеряют оптическу 1 о плоность на спектрофотометре, 1 табл.Изобретение относится к медицине,а именно к биохимической диагностикеа неврологии, и может быть использо.вано для диагностики заболеваний,обусловленных преимущественным поражением нейрона, в результате которого в биологических жидкостях появляется активность аргиназы мозга.Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа при одновременном обеспечении возможностидлительного сохранения образцов,Способ осуществляют следующим оразом. 150,02-0,05 мл (20-50 мкл) сыворотки.крови, предварительно обработаннойраствором формальдегида до его конечной концентрации 0,15-0,3 мкМ, нано. -сят на фильтровальную бумагу, высуши" 20вают при 40"60 С, 2-3 раза промывают 2 Х-ным раствором хлористого калияс последующим высушиваннем при той жетемпературе. Далее обработанную опыт"ную полоску с пробой и контрольнуюполоску того же размера погружают враствор аргинина (100 мкМ/мл) на10 мин и в зти же пробирки вносятпо 2 мл стандартного рабочего раствора для определения мочевины. Пробы 30ставят в кипящую водяную баню на12 мин. В контрольные образцы аргинин вносят на 2-й минуте пребыванияих в бане, Затем пробы охлаждают (23 мин) под струей холодной Водыр иэ .35меряют оптическую плотность на спектрофотометре СФпри длине волны525 нм и выражают результат в единицах (1 ед равнамкМ/мин).Всего обследовано 119 человек, 40из них с диагнозом: острое нарушениемозгового кровообращения (ОНМК) 69,преходящее нарушение мозгового кровообращения 4, гипертоническая знцефалопатИя.(ГЭ) 11, начальные проявления д 5неполйбценности мозгового кровообращения 4, артериальная гипертония(АГ) + начальные проявления неполноценности мозгового крообращения 2,АГ 6. Диагноз подтверждали даннымианамнеза, клинической картиной забо-левания, комплексом клинических ипараклинических методов исследованияс обязательным использованием компьютерной томографии.Контрольная группа включает 23 человека, из них доноров 15, больныхс рассеянным склерозом 4, остреохондрозом 4, Предлагаемый способ позволяет ре": гистрировать появление специфической активности аргиназы мозга в сыворотке крови прн острых нарушениях мозгового кровообращения и ГЭ О, специфичности предлагаемого способа можно судить из приведенных примеров, Активность аргинаэы не определяли в сыворотке крови здоровых людей ( доноры) и практически не наблюдали у неврологических больных с поражением других структур (см. таблицу),Активность аргиназы, ед/л Доноры Остеохондроз Рассеянныйсклероз 0 0 0 0 П р и м е р 1. Больная Л., 57 лет, диагноз; ограниченное кровоизлияние в глубокие отделы левого полушария, гипертоническая болезнь 111 ст.Заболела 16.03.86 когда внезапно развилась .слабость в правой руке и ноге, изменилась речь.При поступлении: состояние сред" ней тяжести, глазные щели ОВЯ, право- сторонний парез мимической мускулатуры, снижена сила в правой руке, объем движений полный, Отмечается повышение мышечного тонуса по пирамидному типу в правых конечностях. Болевая чувствительность снижена с справа по гемитипу. Сухожильные реф" лексы повышены, справа больше, чем слева. Вызывается ладонно-подбородочный рефлекс с обеих сторон. Гипергидроэ, значительно усиливающийся при повышении АД, Нарушение речи по типу заикания.Определяли активность аргиназы по следующей методике: сыворотку крови в количестве 20 мкл, предварительно обработанную раствором фор-. мальдегида до конечной концентрации 0,15 мкМ, наносили на фильтровальную бумагу, высушивали при 40 С, 2 раза промывали 2-ным раствором хлористого калия с последующим высушиванием при той же температуре. Далее опытнуюполоску погружали в раствор аргининана 10 мин и в эти же пробирки вносили по 2 мл рабочего раствора для определения мочевины, Затем пробы ставили в кипящую водяную баню на 12 мин.В контрольные образцы аргинин вносили на 2-й минуте пребывания их в бане. Затем пробы охлаждали и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре Сфпри длине волны.525 нм.Активность фермента в крови, определенная предлагаемым способом, составила 11 ед/л в первый день после 15ОНМК,Поражение ЦНС подтверждено данными компьютерной томографии: в левомполушарии в проекции средне-заднихотделов скорлупы была определена небольшая область интенсивно повышеннойплотности, окруженная небольшой .областью пониженной плотности, что соответствует небопьшому кровоизлияниюв стадии организации описанной локализации.П р и м е р 2. Больной П., 59 лет,диагноз: кровоизлияние в правое полушарие головного мозга. При поступлении: сознание ясное, ориентирован на 30месте и во времени, временами зевота,речь дизартрична. Некоторое снижениенапряжения жевательной мускулатурыслева. Гипалгезия левой половины лица, Сглажена левая носогубная складка, Мягкое небо провисает, язычокуклоняется влево. При фонации небнаязанавеска сокращаетсянесколько ограниченно. При высовывании языка он уклоняется влево. Движение в левой ру Оке отсутствует, в локтевом суставенамек на сгибание, в ноге: выпрямленную ногу поднимает10 от постели,опоставленную ногу с опорой на пяткуне удерживает,в голеностопном суставе 45движений нет, Мышечный тонус умеренно повьппен в сгибателях и пронаторахлевого предплечья, в разгибателях левой голени и приводящих мышцах бедра.Сухожильные рефлексы вызываются 0 ЪЯ.Брюшные рефлексы справа вызываются,50слева отсутствуют. Вызывается симптомБабинского слева. Вызывается ладонноподбородочный рефлекс. Отмечается левосторонняя гемигипестезия. Суставномышечное чувство: расстроено слева55во всех суставах, включая крупные.Активность аргиназы определялипо следующей методике: сыворотку кро 4ви в количестве 50 мкл, предварительно обработанную раствором формальдегида до конечной концентрации 0,3 мкМ, наносили на фильтровальную бумагу, высушивали при 60 , 2 раза промывали 27.-ным раствором хлористого калия с последующим высушиванием при той, же температуре. Далее опытную полоску погружали в раствор аргинина на О мин и в эти же пробирки вносили по 2 мл рабочего раствора для определения моневины, Затем пробы ставили в кипящую водяную баню на 12 мин. В контрольные образцы аргинин вносили на 2-й минуте пребывания их в бане. Затем пробы охлаждали и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФпри длине волны 525 нм,Активность фермента в крови,определенная предлагаемым способом, составила 55 ед/л, При компьютерной томографии головного мозга в правом полушарии, в проекции, преимуществен" но, лентикулярного ядра, определяется свежее кровоизлияние средних размеров (не более 20 смЭ) без признаков прорыва крови в желудочки и субарахноидальное пространство. Правый боковой желудочек частично сдавлен. Имеются симптомы умеренно выраженной деформации среднего мозга и развивающегося перифокального отека.П р и м е р 3, Больной Г 58 лет, диагноз: ГЭ, АГ, атеросклероз.С 17 лет отмечалось повышение АД. В 1979 году ОНМК со слабостью в левых конечностях. С января 1985 г. сла" бость в ногах.В неврологическом статусе: память снижена, гипомимичен, отмечается дизартрия. Некоторая сглаженность правой носогубной складки. Кончик языка уклоняется вправоОтмечается повьппение тонуса в левых конечностях. Сухожильные рефлексы высокие с расширенной рефлексогенной зоной. Клонус стоп. Симптом Маринеску-Родовича справа. Вызывается кистевой рефлекс Россолимо с 2 сторон, ЯЮ. Симптом Россолимо, симптом Бабинского слева и Пуссена справа, Брюшные рефлексы не вызываются. Походка паретическая, мелкими шажками с элементами атаксии. Координаторные пробы выполняет с незначительной интенцией.Заключение психиатра: изменение личности по органическому типу (со" судистого генеза).На серии компьютерных номограммголовного мозга отмечается диффузноесимметричное снижение плотности вбелом веществе семиовальных центровобоих полушарий, которое распространяется также на участкинервнойткани, расположенные вокруг тел боковых желудочков (томографические признаки дисциркуляторной энцефалопатии). Наблюдаются умеренное и системное расширение желудочковой системыи заметное увеличение субарахноидального пространства лобных долей, чтополностью соответствует клиническим 15данным.Активность аргиназы определялипредлагаемым способом, аналогично примерам 1 и 2. Активность мозговой формы фермента в первый день поступления 20в клинику 177 ед/л. На фоне уменьшения очаговой неврологической симптоматики и улучшения общего состоянияна 19-й день активностьмозговой формы Фермента не выявлялась. 25П р и м е р 4. Больной Ш 44 лет,диагноз: ГЭ, гипертоническая болезнь1-11 ст, и начальные явления атеросклероза,В течение последних 15 лет перно(1дически повышается АД до 150-160//90 мм рт.ст. и 170-180/110 при кризах, В 1983 г, отмечал значительноеснижение памяти в течение несколькихдней, которое прошло после лечения,Два года тому назад вновь ухудшиласьпамять, появились затруднение концентрации внимания, трудности в подборе слов, утомляемость, головнаяболь. Самочувствие ухудшилось за последний год, когда головная, боль стала почти постоянной (чаще в затылочной области), появилось головокружение.В неврологическом статусе: легкийсимптом Горнера справа, легкая сглаженность правой носогубкой складки,непостоянный симптом Маринеску-Родовича справа. При выполнении пальценосовой пробы отмечаются элементы интенционного тремора. Гипергидроз ладоней и.стоп,Заключение психолога: высшие корковые функции не нарушены. Некотороеснижение памяти и особенности поведения личности и установок.На серии компьютерных томаграммполучены изображения суб- и супратенториальных образований головного мозга. Патологических изменений в веществе мозга не выявлено. Желудочковая система обычной Формы и размеров, субарахноидальное пространство не изменено.Исследование активности фермента проводили предлагаемым способом, В первый день поступления активность мозговой формы фермента составила 110 ед/л, и на 30-й день, когда на фоне лечения регрессировала очаговая неврологическая симптоматика, исчезли головные боли, головокружение, парез лицевого нерва справа, симптом Маринеску-Родовича справа и интен ционный тремор при выполнении пальце- носовой пробы, активность составила 44 ед/л, что свидетельствует об уменьшении активности процесса.Таким образом, предлагаемый способ является высокочувствительным при определении активности патологического процесса, в частности энцефалопатии.Полученные результаты показали, что мозговая форма фермента не присутствует в сыворотке крови здоровыхлюдей, в то же время активность аргиназы выявлена в сыворотке крови больных с заболеваниями нервной системы,сопровождающимися провреждением нейронов,Предлагаемый способ обеспечиваетснижение травматичности (используетсясыворотка крови в объеме 0,05 мклвместо спинномозговой жидкости), повышение точности, так как позволяетдиагностировать умеренно выраженныеформы дисциркуляторной энцефалопатиии некоторые формы нарушения мозговогокровообращения, а также упрощениеза счет снижения количества стадий вметодике и воэможности длительногосохранения образцов,Формула изобретенияСпособ определения активности аргиназы мозга в сыворотке крови путем отбора пробы, обработки ее раствором Формальдегида, нанесения смеси на носитель, промывания раствором хлористого калия, добавления раствора аргинина и иикубации с последующим определением мочевины, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что,с целью повышения точности и упрощения способа, при одновременной воэможности длительногоЗаказ 3777/47 Тираа 847 . . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Уагород, ул. Проектная, 4 сохранения образцов, в качестве носителя используют фильтровальную бумагу,на которую наносят сыворотку крови в объеме 20-50 мкл, затем высушивают при 40-бО С, а инкубацню с раствором ергинина проводят в течение О мин,