Способ определения количества высокомолекулярных спиртов в растворе

(57) Ибам опки акти можекой хим Изобретение относи определения количеств активных органических способам огически инений и итическойв сельс- еромонов Целью изобр ение разреш я к биол ения является расщей способности сп о а, лов ьпп чувствитается н льности.ом, что гостава в7,8-8,10 - О Способ заключ товят смесь сле 0,1 М фосфатном (конечные концен а может быть применено химии, биохимии, физ г дующего со буфере, р трации); ком хозяистве для ан спиртовой природы на и судАРстВенный кОмитетПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯ И ГКНТ СССР(56) Возя В. О., Ная 1 ей К. Н. Арр 11- са 1 оп оГ руго 11 я 1 я, Еая сгошао 8 гарЬу апй шаяя ярессгощейгу Еог 1 пйепгЫсаоп оЕ а 1 сойо 1 я апй сагЬопу 1).яошегя. - Апа 1. СЬен. 1976, Ч. 48,2, р. 4 17-420.Мартинек К., Хмельницкий Ю. А., Левашов А. В. и Березин И. В. Субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы в коллоидном растворе воды в,органическом растворителе, - Докл. АН СССР, 1982, т, 263,2, с. 737 -ОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ОЛЕКУЛЯРНЫХ СПИРТОВ В РАСТВОРЕ обретение относится к спосоеделения количества биологичес вных органических соединений быть применено в аналитичесии, биохимии, физиологии, в сельском хозяйстве для анализа Феромонов спиртовой природы, микробиологии. Целью изобретения является расширение разрешающей способности способа, повнпение чувствительности.Предложенный способ является принципиально новым подходом к определению количества высокомолекулярных спиртов, т.к, детекция ведется по образовавшемуся в результате реакции алкогольдегидрогеназы со спиртом длинноцепочечному альдегиду, чувствительность к которому бактериальной люциферазы чрезвычайно высока. Способ заключается в том, что раствор исследуемого спирта инкубируют в буферной среде с алкогольдегидрогеназой в присутствии никотинамидадениндинуклеотида, а затем в реакционную среду вводят очищенную бактериальную люцифера- ( зу В. Ьагчеу 1, флавинмононуклеотид и дитионит натрия. Измеряют уровень биолюминесценции смеси, по которому судят о количестве исследуемого спирта. Чувствительность предлагаемого спосо-бба составляет 1 О - 1 О моль для спиртов от деканола до гексадеканола. 1 табл.3 , 149538 алкогольдегидрогеназы, 5 1 О - 10 М никотинамилалениндинуклеотида, раствор исследуемого спирта. Смесь инкубируют 4-5 мин при комнатной темпе 5 ратуре, затем добавляют 0,005 - 0,001 мг/мп очищенной бактериальнойлюциферазы Вепе 1 сеа Ьатчеуь. 2,510 М флавинмононуклеотида и непосредственно перед измерением вводят 2-3 10 М 10 дитионита натрия. Конечный объем смеси составляет 05-0,6 мл, Затем измеряют уровень биолюминесценции сме". си, по которому,с помощью калибровоч- ной кривой определяют количество ис следуемого спирта.Предлагаемый способ является принципиально новым подходом к определению количества высокомолекулярных спиртов, так как детекция ведется не 20 по образовавшемуся в результате реыции НАДН, а по высокомолекулярноМу альдегиду, чувствительность к которому бактериальной люциферазы очень высока.25Предлагаемый способ позволяет определять количество высокомолекулярных спиртов, включая иепредельные, от деканола до гексадеканола, что невозможно с помощью известного спосо30 ба.Пороговая чувствительность приведена в таблице. Пороговая чувстви тельность, мольСоединение Калибровочную кривую строят с учетом эффекта ингибирования люциферазыдодеканолом, вводя поправочные коэффициенты, начиная с 10 М концентра".ции додеканола, полученные при измерении интенсивности свечения смесипри отсутствии алкогольдегидрогеназы.Кроме того, из полученного значенияинтенсивности вычитают фоновое свечение, измеряемое при отсутствии в смеси додеканола.Диапазон линейности калибровочнойкривой в координатах 1 я 61/18 С длядодеканола составляет 10 - 10 М,Например, если 1 п = 0,8 мВ при1 0,7 мВ и к = 1, то получают кон. центрацию додеканола в пробе, равную10 М,П р и м е р 2. Все операции проводят аналогично примеру 1, но беруттетрадеканол. Например, если 10,9 мВ при 1 ф = 0,75 мВ и к = 1,7 10 ГексанолОктанол.ДеканолДо дек анолТе традек анол 5 1010 1045 1010 Цис-гек садеценол 501 О Иис-гексадеценол 5 10 Известный Предлагаспособ гаемыйспособ 40 55Из таблицы видно, что пороговая чувствительность предлагаемого способа в 10 раз вьппе по сравнению с из-.вестным (для деканола). 24П р и м е р 1, Берут слеклянный стаканчик, снабженный мешалкой, и в нем готовят смесь следующего состава в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,9 (конечные концентрации): 10 М алкогольдегидрогеназы (АД) с активностью 25 ед/мг, 510 М никотинамидадениндинуклеотида (НАД), В смесь вносят 0,01 мл раствора додеканола и инкубируют при комнатной температуре и перемешивании 4 мин, Затем в реакционную смесь добавляют 0,005 мг/мп очищенной бактериальной люциферазы В, Ьагчеу с удельной активностью. 75 мВ/мг по дитиониту натрия, 2.10 М флавинмононуклеотида (фМН) и непосредственно перед измерением вводят 2 1 О М дитионита натрия. Конечный объем смеси составляет 0,5 мл.Стаканчик помещают в кюветное отделение фотоиетра с детектором света и значение интенсивности биолюминесценцин (1) определяют по второй вспьппке, которое выражают в милли- вольтах (мВ). Полученное значение 1 с учетом поправочного коэффициента на ингибирование (к) и за вычетом фонового свечения (1) используют для определения концентрации додекаиола в пробе по калибровочной кривой.Для построения калибровочной крирой используют. 10 М раствор додекаиола в этаноле, разбавленный водой в10 - 10 раз.а в95382 тельности способа,30 35 40 45 50 55 5 14то получают концентрацию тетрадеканола в пробе, равнув 10 6 М,Диапазон линейности калибровочнойкривой 10 8 - 10 М,Ингибирование и введение поправо 7 чных коэффициентов начинается с 10 М.П ри м е р 3. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берутцис-гексадеценол. Например, если1 = О 85 мВ при 1, = О 7 мВ и к = 1,то получают концентрацию в пробе,равную 1 О М.Диапазон линейности калибровочнойкривой 10 8- 10 М,Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 5 хх 1 ОП р и м е р 4, Все операции проводят аналогично примеру 1, но берутреагенты в следующих соотношениях:10 М АДГ, 10 М НАД, 0,01 мг/мл люциферазы, 5 10 М ФИН, 3 10 М дитионита натрия в 0,1 М фосфатном буфере,рН 8,1. Конечный объем смеси составляет 0,6 мл.Диапазон линейности калибровочнойкривой для деканола 10- 10 М.Например, если 1 7,0 мВ при1 = 6,2 мВ и к = 1, то получают концентрацию деканола в пробе, равную10 М.Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 5 хх 10 М,П р и м е р 5. Все операции проводят аналогично примеру 4, но берут цис-гексадеценол. Например,если 1 = 7,6 мВ при 1 = 6,3,мВ ик = 1,1,то 1 с учетом к равно8, 4 мВ, что соответствует 5 10Мконцентрации в пробе.Диапазон линейности калибровочнойкривой 5 10 о М.Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 5 хх 10 М,П р и м е р 6. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берутреагенты в следующих соотношениях;5 10М АДГ, 1 ОМ НАД, 0,001 мг/мллюцеферазы, 210 М ФИН, 2 1 О М дитионита натрия в 0,1 М фосфатном буФере, рН 7,5. Конечный обьем смесисоставляет 0,5 мл.Например, если при определениидодеканола 1 = 0,2 мВ при 1,= О, 2 мВ и к = 1, то превьппейия над Фоном не наблюдается и додеканол неопределяется.Выход за диапазон оптимальных концентраций реагентов в сторону уменьшения приводит к невозможности определения спиртов,П р и м е р 7, Все операции проводят аналогично примеру 1, но берутреагенты в следующих соотношениях:5 О М АДГ, 5 10 М НАД, 0,05 мг/мллвциферазы, 5 (Т М ФМН, 3.10 М дитионита натрия в 0,1 М фосфатном буфере, рН 8,0. Конечный объем смесисоставляет 0,6 мл.Например, если при определениитетрадеканола 1 = 17,6 мВ при 1917,4 мВ и к = 1, то получавт концентрацию, равную 10 М.20 Выход за диапазон оптимальных концентраций реагентов в сторону увеличения приводит к ухудшению чувствиИспользование предлагаемого способа имеет следующие преимущества перед известными способами подобного рода: возможность определения количестванасыщенных и ненасыщенных спиртов от деканола до гексадеканола, ловленнаячувствительность способа. Ф о р м у л а и з о б,р е т е н и я Способ определения количества высокомолекулярных спиртов в растворе, включающий приготовление реакционной смеси в Фосфатном буфере, содержащей алкогольдегидрогеназу, никотинамилалениндинуклеотид и раствор исследуемого спирта, определение скорости Ферментативной реакции Физико-химическим методом с последующей оценкой количества исследуемого спирта, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью расширения разрешающей способности и повыпения чувствительности способа, в реакционнув смесь дополнительно вводят 0,005-0,001 мг/млочищенной бактериальной лвциферазы ВепеКеа Ьагчеуь., 2 10 - 5 10 М Флавинмононуклеотида, 2 10 - 3 10 М дитионита натрия, а скорость Ферментативной реакции определявт по уровню биолвминисценции смеси, ло которой при помощи калибровочной кривой. проводят оценку количества исследуемого спирта.