Способ определения жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в нитрагине

Союз СоветскинСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и 935529Опубликовано 15 06 82 Боллетеиь Рй по делам изобретений и открытий(53) УДК 63:576,8: :631.8 (088.8) Дата опубликования описания 15,06,82 Ю. Т, Калинин, А, Н. Мезенцев, В. Х, Тихонов, В, Л, Земляков, Б, И. Голод и Е, В, Чекасина(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ В НИТРАГИНЕИзобретение относится к сельскохоэяйствеиной микробиологии и может быть использовано в сельском хозяйстве.Известен способ определения количестважизнеспособных клеток клубеньковых бактерий, который заключается в том, что воднуюсуспенэию препарата высевают на элективнуюогариэованную питательную среду (1.Однако способ требует для осуществлениязначительного времени (8 - 10 дней) из - за мед 10ленного роста клубеньковых бактерий на питательной среде.Известен также спосос определения микроорганизмов с помощью флуорогенных субстратов эстераз, по которому клетктот микроорганизмов инкубируют при 37 - 40 С в течение 1 О - 15 мин с флуорогенными субстратамиэстераз, имеющими конечную концентрацию 0,5 -2,0 мкг мл, после чего суспенэию просматривают в люминисцентом микроскопе и регистРируют флюоресцирующие клетки 2.При использовании данного способа в суспен.зии нитрагин он не дает возможности проводить такое определение, так как применяемые в способе концентрации флуорегснных субстратов эстсраз (флуоресцендинацетата и Флуоре. сцеиндибутирата 2,0 - 0,5 мкг/мл) практически не окрашивают клетки клубеньковых бактерий.Целью изобретения является сокращение времени определения и повышение его точности. Поставленная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу водную суспензию нитрагина инкубируют с флуорогенным субстратом - эфиром низшей жирной кислоты (например, с. флуоресцеиндибутиратом), в конечной концентрации 50 - 100 мкг/мл, причем для усиления флуоресцентной окраски клеток инкубацию проводят при 50 - 55 С.При инкубации клеток с флуорогенным субстратом, не обладающим флуоресценцией, эстеразы жизнеспособных клеток гидролизуют его и освобождающийся флуорохром накапливается в клетках, придавая им яркую флуоресценцию.При использовании в качестве флуорогенных субстратов эфиров низших жирных кислот клетки мертвых микроорганизмов и час тицы наполнителей (торфа, мела и т, д.), ооизме935529 римые с размером клеток, при подобной окраске обладают слабой флуоресценцией или не имеют се.В качестве флуорогенньх субстратов могут исольэоеаться сложные эфиры флуорохромов, содержащих гидроксильную группу, и низших жирных кислот. Наиболее доступными являются флуоресцеиндиацетат и флуоресцеиндибутират. Так как флуоресцеиндибутират более устойчив при хранении, имеет значительно меньшую степень спонтанного гидролиза, более дешев, чем флуоресцеипдиацетат и дает фактически такую же картину при окраске клеток, то его использование предпочтительнее. В зависимости от задач анализа могут использоваться и другие эфиры, вызывающие свечение жизнеспособных клеток в других областях спектра.Лучшее окрациванне клеток в суспензии нитрагина достигается при применении субстратов в кошентрапиях от 50 до 100 мкг/мл.При окраске субстратами в концентрации ниже 50 мкг/мл наблюдается слабое окрашивание жизнеспособных клеток, при котором визуальный счет клеток затруднен и сопровож дается большими оцибками, Низкие концент-. рации субстратов,меньше 1,3 мкг/мл), ис. пользуемые в известном способе, практически не окрашивают клетки клубеньковых бактерийПовышение температуры инкубации с 37 -о о40 С до 50-55 С приводит к увеличению сигнала флуорссценции клеток при окраске большими концентрациями флуоресцеиндиацетата в среднеь на 40%. Подобная картина отмечается и в случае применения флуоресцеиндибутирата.Визуальный подсчет клеток удобно проводить под люминесцентным микроскопом в клеточных препаратах, приготовленых по Виноградарскому в Шульгин, Способ в визуальном варианте счета может использоваться и для предварительной оценки содержания в образце жизнеспособных клеток постороннейТаблица 1 Состав пробы Сигнал люминесценции от клеток относительные единицы, М 2 г, п=20 Жизнеспособные клеткиМертвые клетки 45+ 3 52+2 Ризобин + флуоресцеиндиацетат00 мкг/мл Рзоторф -флуоресцеицибутират 100 мкг/мл микрофлоры, отличающихся морфологнческиот клеток клубеньковых бактерий. Общаядлительность анализа при применениирнногоспособа составляет 1,5-2 ч: получение воднойсуспензии нитрагина 1 ч о ТУ), инкубациясуслензии с субстратом 15 мин, счет клеток вклеточном препарате визуально 30-40 мин,счет в суспензии автоматически 5- О мин,На чертеже показана зависимость величиныО сигнала люминесценции отдельных клеток клубеньковых бактерий в риэоторфине от концентрации флуоресцеинлиапетата и температурыинкубации.Ось абсцисс - темлература инкубзнии;Ь ось ординат - величина сигнала люминесценции;кривая 1 - 100 мкг/мл флуоресцеинднаце.тата в растворе;кривая 2 - 50кривая 3 - 2кривая 4 - 0,5Сигналы люминесценции сняты на микроскопе Люмам И - 1 с помощью фотометрнчсской насадки.Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.П р и м с р 1. К 0,9 мл водной суспензии ризобина, приготовленной известным способом, добавляют 0,1 мл раствора фгуоресце.индиацетата в ацетоне мг/мл), инкубируютЭО опри 55 С в течение 15 мин, затем добавляют1 мл 0,06%-ого агара, перемешивают, наносят0,02 мл на участок предметного стекла пло 2щадью 6 см, равномерно распределяют суспензию по площади, подсушивают и считают флуоресцирующие клетки известным способом.П р и м е р 2, К 0,8 мл водной суспензии ризоторфина приготовленной известнымспособом, добавляют 0,1 мл раствора флуоресцеинднбутирата в ацетоне мг/мл) и обра 40 батывают как указано в примере 1.Данные экспериментов привелень втабл. 1,5 935529 6Сравнительные данные по определению способами: предлагаемым и контрольным по.числа жизнеспособных клубеньковых бактерий сева на питательную среду представлены вв одних и тех же партиях нитрагина двумя табл. 2,Таблица 2 Количество жизнеспособных клеток в образце по способу, %Продукт предлагаемому контрольному Окраска флуоресцеиндиацетатом (длительность 2 ч) Посев на питательныесреды (длительность8 - 10 дней) Ризобин Ризоторфин 98 100 1и для определения жизнеспособных клетокдругих видов микроорганизмов, используемыхв микробиологической промышленности. Формула изобретения Иэ табл. 2 видно, чтапредлагаемым способом определяется практически такое же количество жизнеспособных клеток клубень- д ковых бактерий в нитрагине, как и контрольным посева на питательные среды, применяющимся на производстве.Применение предлагаемого способа дает положительный эффект, так как способ позволяет практически сразу же мосле получения продукта проводить анализ и отправлять его потребителю, а не хранить 8 - О дней на складе, пока проводится анализ способом, при меняемым в промышленности, в результатеЗэ чего часть клеток в продукте погибает,Способ может использоваться для определения числа жизнеспособных клеток клубеньковых .бактерий в культуральной жидкости, взятой из ферментера на разных стадиях ферментации, т. е. может использоваться для контроля процесса ферментации.Способ был успешно испытан при анализе риэобина на Лотошинском биохимическом заводе, кроме того, он может применяться Способ определения жизнеспособных клетокклубеньковых бактерий в нитрагпне, включающий инкубирование суспензии нитрагина с флчорогенным субстратом эстеразэфиром низшейжирной кислоты и регистрацию флюоресцирующих клеток, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью сокращения времени определения иповьппения.его точности, обработку проводятконцентрацщщи субстрата в интервале 50 -100 мкг/мл, причем для усиления флуоресцентной скорости клеток инкубацию клеток прооводят при 50-55 С.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, ТУ 59 - 91 - 76,2. Мч 4 ораФо 1 оуа, 66, Мф 3, р. 175, 1979933529 Составитель МТехред А,Ач шпиков едактор А. Гульк аказ 4158 3 одписное4/5 оектная, 4 5комитетаткрытийкая наб. ТиражВНИИПИ Государственногопо делам изобретений и3035, Москва, Ж, Раущ илиал ППП "Патент", г. Ужгород, у ректор В. Синицкая