Способ получения протопластов мицелиальных грибов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК 19) (11) 12 Б 1/06 //(С 12 Б12 В 1:645) ПИСАН ОБРЕ ЕЛЬСТВУ ЕНИЯ(21) 4110984/3 (22) 14.07.86 (46) 5,05.88(71) Институт и Всесоюзный Институт биот а, О,а жемякиВ.ров в ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ АВТОРСКОМУ СВИДЕ Бюл, У 18биохимии нм. А.Н, Бах аучно-исслеровательск хнологии.топластов и локамицелии гриба АврПрикл. биохимия1985, ХХ 1, 5, с.Загель М. Кобпротопластов и лазы-1,3-глюканзы в мицелии грисошрас 1 цш. -Прробиология, 1980 К., Летунова Е,Образование пизация ферментоегд 111 из с 1 ауа 1 цв.микробиология,587-591.ева Н. Л. Получениекализация рибонуклеазы и глюкоизомераа РепхсШцш дгечиклбиохимия и мик-,Х 7, 2, с. 245-248,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОППАСМИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ(57) Изобретение относится к биологии, а именно к способам ферментативного разрушения клеточной стенки мицелиальных грибов для получения протопластов, и может быть использованов биохимических, микробиологическихи генетических исследованиях. С цельюупрощения процесса и увеличения выхода протопластов в способе, включающемвыращивание гриба на синтетическойпитательной среде и инкубацию мицелия в присутствии стабилизатора в лизирующей системе, состоящей из фер 1ментов микробного происхождения, воптимальных условиях, инкубацию мицелия в присутствии стабилизатора про- аводят в растворе ферментного препарата целлоконингина П 10 Х в концентрации50-100 мг/мл при температуре 20-28 С сослабь)м встряхиванием в течение 5-6 ч. СПреимущество предложенного способазаключается в упрощении процесса и 3получении 1007-ного выхода протопластов за сравнительно короткий срокИзобретение относится к биологии,а именно к способам ферментативногоразрушения клеточной стенки мицелиальных грибов для получения прото 5пластов. Предлагаемый способ можетбыть использован в.биохимических,микробиологических и генетическихисследованиях в частности для изучения внутриклеточных ферментов и 10структур, локализации и секрецииферментов.Цель изобретения - упрощение способа и увеличение выхода протопластон, 15Согласно предлагаемому способу получения протопластов иэ мицелиальныхгрибов, включающему выращивание гриба на синтетической питательной средеи инкубацию мицелия в присутствии 20стабилизатора в лиэирующей системе,состоящей из ферментов микробногопроисхождения, в оптимальных условиях,инкубацию мицелия в присутствии ста билизатора проводят в растворе ферментного препарата целлоконингинП 10 х в концентрации 50-100 мг/мп прио20-28 С со встряхиванием н течение5-6 ч.ферментный препарат целлоконингин, П 10 х содержит комплекс ферментов,включающий целлюлазу, ксиланазу, литические ферменты и др,Способ осуществляют следующим образом.В 0,2 М раствор фосфатного буфера рН 6,0-8,0 добавляют пеллоконингин П 10 х в концентрации 50-100 мг/мл и стабилизатор. В полученную лизирующую систему помещают мицелий гриба в концентрации 80-120 мг/мл и инкубируют при 20-28 С в течение 5-6 ч при слабом встряхивании. При концен 45 трации ферментного препарата меньшейо чем 50 мг/мл и температуре ниже 20 С не происходит полного превращения мицелия в протопласты, а при концентрации большей чем 100 мг/мл и температуре выше 28 С происходит лизис ми целия без образования протопластов. Концентрация мицелия и время инкубации не являются существенными отличительными признаками способа, так как процесс не зависит от концентра ции мицелия, а его продолжительность определяется временем полного превращения клеток в протопласты. П р и м е р 1, 6 г свежевыращенного мицелия Аэрегф 11 иэ с 1 ачаСыэ1811 тщательно отмывают дистиллированной водой на воронке Бюхнера иодин раз раствором 0,8 М маннита в0,2 М фосфатном буфере рН 6,2,Полученный сырой мицелий помещаютн лизирующую систему, которую готовятследующим способом.3 г препарата целлоконингин П 10 храстворяют при перемешивании в течение 15 мин на магнитной мешалке в60 мл 0,2 М фосфатного буфера рН 6,2и нерастворившиеся частицы удаляютцентрифугированием в течение 20 минпри 7 тыс,об/мин. К надосадочной жидкости добавляют маннит до конечнойконцентрации 0,8 М, Суспенэию инкубиоруют при 20 С в течение б ч при слабом встряхивании. По истечении этогосрока под микроскопом видно, чтопрактически все клетки мицелия превратились в протопласты, которые быстров течение 2-3 мин претерпевают осмотический лиэис при добавлении воды -характерный признак протопластов,Протопласты отделяют от среды центрифугированием при 4 тыс.об/мин,в тече"ние 10 мин и промывают растворомстабилизатора.П р и м е р 2, Способ осущест"вляют согласно примеру 1, но используют ферментный препарат целлоконингин П 10 Х в концентрации 100 мг/мл иинкубацию ведут в течение 5 ч прио20 С, В результате получают полноепревращение клеток в протопласты. П р и м е р 3; По 200 мг свеже- выращенного и отмытого мицелия помещают в 6 пробирок. В каждую пробирку добавляют по 2 мл отцентрифугированного раствора целлоконингина П 10 Х в концентрации 50 мг/мп, содержащего 0,8 М маннит. Первую партию пробирок (3 повторности) инкубируют при 40 С, вторую партию пробирок (3 повторности) инкубируют при 28 С. Результаты наблюдения в оптическом микроскопе. показывают, что в пробах, инкубированных при 40 С уже через 30 мин наблюдается полный лизис мицелия при полном отсутствии протопластов, В пробах, инкубированных при 28 С уже через 30 мин можно видеть, что удлиненные клетки мицелия превратились в круглые, а .в поле зрения видны отдельные свободно плавающие протопла1395665 Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет получать протопласты мицелиальных грибов с выходом 1003, при этом по сравнению с известным упрощается процесс получения протопластов за счет использования одного ферментного препарата вместо трех,Составитель В. СоинаРедактор И. Недолуженко Техред И.Верес Корректор А, Обручар Заказ 2466/26 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 сты. Процесс образования протопластов заканчивается через 17-20 ч,П р и м е р 4. По 200 мг свеже- выращенного и отмытого мицелия помещают в 6 пробирок, В каждую пробу добавляют по 2 мл отцентрифугированного раствора ферментного препарата целлоконингина П 10 Х в концентрации 50 мг/мл содержащего 0,8 М маннит. Первую партию пробирок (3 повторноости) инкубируют при 28 С без встряхивания. Вторую партию пробирок (3 повторности) инкубируют при 28 С со слабым встряхиванием. Результаты наблюдения в оптическом микроскопе показали, что в пробах, инкубированных со встряхиванием, процесс образования протопластов заканчивается через 5-6 ч, т.е, в 3-4 раза быстрее, чем в пробах, инкубированных без встряхивания (17-20 ч).После завершения процесса образования протопластов в среде выделения при наблюдении в микроскоп не видно остатков неизмененного мицелия. Полученные протопласты стабильны при выделении и хранении. Они не лизируют в процессе центрифугирования, а в растворе стабилизатора при 4 С сохраняются без изменения в течение недели. Лизат протопластов бып ис-. пользован для выделения мембраннойФракции и мембранно-связанных ферментов.5 15 Формула изобретения Способ получения протопластов мицелиальных грибов, предусматривающийвыращивание грибов на синтетическойпитательной среде, инкубацию мицелияв буферном растворе, содержащем ферменты микробного происхождения иманнит в качестве стабилизатора про-.топластов, о т л и ч а ю щ и й с я 25 тем, что, с целью упрощения процессаи увеличения выхода протопластов, вкачестве ферментов микробного происхождения используют препарат целлоконингин П 10 Х в концентрации 50 - 30 100 мг/мл, при этом инкубацию ведутпри встряхивании и температуре 20 -28 С в течение 5 - 6 ч.