Способ выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты из дезоксирибонуклеопротеидов

(19 С 07 Н 2 СЯ,"0 Н),ч, рНф ф Е ИЗОБРЕТЕНИСВИДЕТЕЛЬСТВУ ПИ ТИЬ " К АВТОРСКОМ низации без воздействия потенциальноденатурирующих агентов в виде детергентов и органических растворителейвысокополимерные концентрированныепрепараты ДНК (4-6 10 Дальтон,0,2 мг/мл) с высоким выходом (947)и содержанием белка менее 17, Цельизобретения состоит в повышении выхода и степени очистки высокополиконцентрированных препаратов зобретение заключается в удабелков иэ раствора ДНП, депроированного солью, путем связы- белков высокодисперсными сильыми катионитами при постепеннижении ионной силы раствораФ щью диализа. мерныхДНК,ДЕЗОКСИРИБОНУ ЗОКСИРИБОНУКен теини вания ится к областиии и позволяе нокисл ном по с помо вой депротеи ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Институт медицинской генетАМН СССР(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ДЕЛЕОПРОТЕИДОВ11 зобретешсе относится к бцс.ссс бцотехтсолос цст и может бсстс сп.поль зонацо и научтсых лабораториях биохттщтестого бцофцзцческос о тсолеку 5 лярссобцолопсческого профся сс н тс 1 тоФлсыссстсесстсосс проттзнодстве для получения зуется нс н ниде децротетснтс гцруощего ДНГ агента, а н иде;сстсорбетста, косскурсспутоссссс о с т 1 НК за бо.сктс п про цсссе у.тестшаття солевой концентраццц дтсалцзом от депротеццзструющей ДНГТ,ссо фцзцолопсческоц. Ка сссоштт, претсстанляющцй собой сцонтанссо ссдсп с тцрующссеранулы (5, 5 19,5 мкм), осстждается вместе со сияпсес бел;осс, а пресврат ДНК остается н тсадосадке в виде раствора. Ос;тхсдесстсе естттсотссста сстжтсо уссоттгс ь цетстртсфугцронашссм смесц соссе;ссса 35 :вза.П р и м е р 1, 20 г снежезаморожетсной тс;анц ттсмуса теленк тс", се:сьсают сс дсстсерт труот в 300 м,с стандартого раствора (0,075 И ГссС. + + 0,024 И ;а3 ДТЛ, рН 8,0) с стоссосстьсо 30 ножевого с осто етстсзаторст прц 12000 об/мисс н течение 2 мцн. омогетсат Фцл гсрусот через 4 с.соя тарлицест" рттфугцруют 10 мтш прц 2000 я. Падосадок удаляют, а осадок нтсотть дцспсргссруют н 300 мл сташсартного 45 растнсра н гомогенизаторс прц 8000 об/мцн н течешсс 20 свновь осаждасот прц том же режиме центрнфу 50 гцронанця. Последняя операция отмывки осаждсттосцет ося хроматцна от рцбонуклсопротецдов повторяется 6 раз. Бось сроцесс выделения 11 НП проводят прц 4 С. После последней отмывки по 55 лучешсый ДНП диспергируют н О, 15 М ,ГаС 1 + 0,7 мИ Га-фосфатном буфере (рН 7,0), Дисперсия разбавляется до состояния, когда она со;тержцт коссс ссомощью простейосих операцттц ц практически безотходной технолос шт нысокостсстьсх препаратов ньссокоцолцмерной 1 О Д 11 К, наиболее приближенной к натцвному состояшло.сель ттзобретения - повышение выхода тс степесс очистки нысокопо.сцмершсх (сс-б 10 Дальтон) сотсссетстртсронанных (0,2 мг/мл) препаратов ДНК.Повышение тзыхода и степени осттсткц обеспечивается в резулт тате испоьзостатстся н качестне тзбсссте:ть ного алсорбента для отделения белка 20 ос,1 "ссссьссокцслотного г,сс с;оссссперсного катцонцта. Кст ттсо:;и сссцольттентраццю ДНК, вдвое превышающуто необходимую исследователю концентрацию препарата. Последняя в нашем случае составляла 0,2 мг/мл. К дисперсии прц:цшают раннытт объем раствораГ МаС 1 на фосфатном буфере и полученный раствор (С =0,2 мг/мл) ино кубцруют не менее 3 ч при 4 С. Катцошст Лтсст.пех Аб, ВЮ.США (15 смэ ) дссспергцруют в 30 мл 2 Г ГаС 1 и через 30 мцн центрифугируют при 1500 д н течение 1 мин, Надосадок сливают и добанлятот двойной объем (30 мл) полученного ранее раствора ДНП в 2 М Г 1 аС 1. Катионит тщательно перемешивают с раствором до однородной консистенции ц помещают н воронку, широкий конец которой закрыт целлофаном, закрепленным резиновым кольцом в цилиндрической части воронки. В воронку помептатот Г-образнуто стеклянную палочку, вращаемую в смеси электромотором со скоростью 10 об/мин для предотврасссесстсл оседания гранул катионита. Ниж шсй конец норонки погружают в сосуд с с 1 ясзцолопсческим раствором (0,15 М ГаС 1 + 0,7 мМ Г 1 а-Фосфатньсй буФер, рН 7,0, объем 1 л), перемешиваемым с помощью магнитной мешалки. Диализопроводят 12 ч при 4 С. Затем смесь тсз вороньи центрифугцруют при 1500 в 1 иттс. Надосадок представляет собой препарат ДГК в виде раствора с концентрацией ДНК 0,2 мг/мл в среде с Фцзцолопсческой ионной силой. Растноритель можно выбрать с меньшей цонной силой, что не сказывается на качестве препарата ДНК.П р и м е р 2, Операции вьтделенця ДНК из ткани тимуса теленка соответствуют примеру 1. Препарат ДНК, вьсстелетссссстс н Физиологической среде (0,15 Г 1 ГаСГ), переводят в 2 М Г 1 аС 1 добавлением равного объема раствораГГ;1 аС 1. 16 мл ДЕ 1 П в 2 И ГаС 1 при С, = 0,2 мг/мл цнкубируют в течение 3 ч при 4 С для растворения препарата. Катионцт Онат.оп т.чАГ 1(16 мл) дцспергирусот в 32 мл 2 И ГаС 1 и через 30 мин центрифугируют при 1500 К н течение 1 мин. Надосадок сливают и добавляют 16 мл раствора ДНП в 2 И ГаС 1, Объемное отношение в смеси катионит/ДНК = 1. Смесь тщательно перемешивают, а затем проводят удаление соли диализом, Диализ ведут против 1 л раствора 0,15 М ГаС 1 + + 0,7 мМ Га-Фосфатньсй буфер (рН 7,0)1373709 3 1 О Составитель Т.ЗабойкинаРедактор Н.Киштулинец Техред М.Моргентал Корректор М,Демчик Заказ 533/19 Тираж 348ВНИИПИ Государственного, комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 либо против 0,7 мМ Ма-фосфатного буфера (рН 7,0) в течение 16 ч при 4 С Смесь центрифугируют 30 с при 2700 в. Надосадок представляет собой раствор ДНК в физиологическом растворе. Характеристика полученного препарата ДНК: белок/ДНКОу 01 Срц Оу 2 мг/мл выход ДНК иэ ДНП составил 887 Молекулярная масса препаратов ДНК, полученных на данном катионите, находится в диапазоне 4-6 10 Дальтон. Предлагаемый способ позволяет получить препараты ДНК с массой, определенной методом вискоэиметрии, 4-6 10 Дальтон, с содержанием белка менее 17 при Сщ, = 0,2 мг/мл. Выход ДНК иэ препаратов ДНП составляет88-947.Формула изобретения Способ выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты иэ деэоксирибонуклеопротеидов с помощью солевой депротеинизации, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьпдения выхода и степени очистки высокополпмерных концентрированных препаратов ДНК, удаление белков иэ раствора прс- водя.г путем сорбции их на высокодигперсных сильнокислотных катионитах, понижая ионную силу раствора с помощью диализа, при этом ДНК остается в растворе.