Способ определения тимидина в биологической пробе

(51)4 С 01 ИЗ ВЕНКЫЙ КОМИТЕТ СССР ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ГОСУД АРСПО ДЕЛ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ пособа. Кл ки те ую пендируют, док суспендс аденоэинт ток костног скин ин медицин добавляют реакциным содержаниемют. Добавляют внаносят на хромПосле промывкиливают сцинтиллсчитывают радиоровочному графирацию тимидинатабл. ина Т ся к био ощение АВТОРСКОМУ СВИ ТЕЛЬСТВ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЕ(57) Изобретение относимии. Цель изобретения -костного мозга сусцентрифугируют. Осав лизирующей смеси фатом. К лизату клега с тимидинкиназой онкую смесь с различтимидина и инкубирупробы этанол и смесь тографическую бумагу. ума)кные подло)кки зационной смесью и проктивность. По калибу определяют концентпробе. 1 ил.,1364990 2 10 1 г 20 25 30 35 40 45 50 Изобретение относится к биохимиии может найти применение в медицинев случаях, когда проводится лечениеантиметаболитами нуклеиновых кислот,а также в тех случаях, когда тимидиниспользуют в качестве лечебного средства в антираковой терапии.Целью изобретения является упрощение способа за счет сокращения количества стадий,Поставленная цель достигается тем,что согласно способу определениятимидина в биологической пробе, включающему инкубацию ее со специфическимзбелком в присутствии Н-тимидина споследующей очисткой полученного продукта и определением тимидина по калибровочной кривой уровня радиоактивности полученного продукта, в качестве специфического белка используютлизат клеток костного мозга, а инкубацию осуществляют в присутствиинасьпцающей концентрации аденозинтрифосфата, далее полученный продукточищают хроматографически.П р и и е р 1. Получение лизатаклеток костного мозга, содержащеготимидинкиназу.1,1.10 клеток костного мозга избедренных костей пяти мьппей линииСВЛ суспендируют в 4 мл физиологического раствора при 4 СОсаждают центрифугированием при 2000 об/мин 10 минна центрифуге ЦЛС. Осадок суспендируют в 2 мл холодной лизирующей смеси, содержащей, М: КС 1 0,0 1; МяС 10,002; трис 0,01; аденозинтрифосфат0,001; меркаптоэтанол 0,01; аминокапроновая кислота 0,05;. 0,6 мг/млбычьего сывороточного альбумина;10 мкМ МаГ, и переносят в чистые пластиковые пробирки по 0,5 мл. Клеткиразрушают поочередным замораживаниемов жидком азоте и оттаиванием при 37 Св водном термостате, Процедуру повторяют трижды. Полученный лизат просветляют центрифугированием при16000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант лизата клеток костного мозга,содержащий тимидинкиназу, разливаютв чистые пробирки по 0,5 мл и хранятв жидком азоте, Процедура занимает1,5 ч.На чертеже показано построениекалибровочного графика.Составление полной реакционнойсмеси. Для построения калибровочнойкривой к 0,1 мл начальной реакционной смеси, содержащей, М: трис О, 15; аденозинтрифосфат 0,0 1; МяС 1 0,0 1; ИаГ 0,025; меркаптоэтанол 0,01, рН 7, добавляют по 25 мкл водного раствора тимидина различной концентрации (10;7; 5; 1; 0,5; 0,1 мМ) и по 25 мкл Н-тимидина (1,87 вСь./мл; 40,4 мкМ),Составление полной инкубационной смеси. Для составления полной инкубационной смеси к 20 мкл лизата клеток костного мозга, содержащего тимидинкиназу, добавляют по 30 мкл полной реакционной смеси с различным содержанием тимидина. В качестве контроля берут пробу, содержащую 20 мкл лизирующего раствора (вместо клеточного лизата) и 30 мкл полной реакционной смеси.Инкубация и анализ результатов. После составления полной инкубационо ной смеси пробы инкубируют при 37 С в течение 15 минЗатем реакцию останавливают, добавляя в кажду пробу по 13 мкл этанола. По 50 мкл из каждой пробы наносят на кружки из хроматографической бумаги Ва 1 шап АЕили ДЕдиаметром 2,2-2,3 см, бумагу подсушивают. Затем бумажные кружки трижды отмывают дистиллированнойводой, один раз этанолом и эфиром.Сухие бумажные подложки переносят вофлаконы, заливают по 5 мл сцинтилляционной смеси и просчитывают радиоактивности на счетчике импульсов.Определение содержания тимидина в плазме крови мыши, Тимидин концентрацией 60 мг/мл вводят внутрибрюшинно иэ расчета 3,0 мг на 1 г веса животного. Через промежутки времени 2 ч30 мин; 6 ч 30 мин и 12 ч у животногоберут кровь из вены, переносят еев центрифужные пробирки. Сывороткуотделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин, Затемсоставляют полную реакционную и полную инкубационную смеси как описановыше, за исключением того, что присоставлении полной реакционной смеси вместо раствора тимидина добавляютпо 25 мкл сыворотки, содержащейнеизвестное количество тимидина. Инкубацию проб и анализ результатовпроводят как описано при построении калибровочной кривой. Результаты определения содержания тимидина в сыворотке крови представлены в таблице.15 Фо 1 мула изобретения Время после Степень фосфорилирования эН-тимидина, имп/мин Содержаниетимидина Способ определения тимидина в биологической пробе путем инкубациисо специфическим белком в присутствииН-тимидина с последующей очисткой3полученного продукта, регистрациейсвязанного тимидина и расчетом покалибровочной кривой, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упро щения способа за счет сокращения числа стадий, в качестве специфическогобелка используют тимидинкинаэу в лизате клеток костного мозга, а инкубацию проводят в присутствии насы щающих концентраций АТФ. инъекции,ч-мин в плазме, мМ 2 - 30 6 - 30 8 28721 244 7,8 1,7 12 - 00 42 977 О, 15 Исходя из полученных значений радиоактивности, используя калибро цнп(ион гЮ ЯСоставитель В.МесянжиновТехред Л,Сердюкова Корре И.Эрдей дактор Н.Гунько Подписноеомитета СССРоткрытийшская наб., д. 4 Тираж 847 1 ИИПИ Государств по делам изобр 13035, Москва, ЖЗаказ 6591 37 ног ете -35 роиэночечненно-нопиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4 з 1364990 4данные о влиянии концентрации не- вочную кривую, находят, что содержа- меченого тимидина на фосфорилирование ние тимидина в плазме после инъекции меченого Н-тимидина (калибровочный через указанные промежутки времени график зависимости уровня радиоактив- составляют соответственно 7,8; 1,7;5ности полученного продукта от кон-0,15 мМ.центрации тимидина в пробе, где точ- Из приведенных результатов следуки (Б ) соответствуют уровню радио- ет, что полученный калибровочный активности полученного продукта при график позволяет эффективно различать измерении содержания тимидина в сыво содержание в биологической пробе неротке крови мыши через разные проме- меченного тимидина концентрации жутки времени после введения ей пре- от О, 1 до 1 О мИ, Вся процедура измепарата тимидина) представлены на чер- рения тимидина занимает 2,5-3 чтеже.