Способ количественного определения иммунных комплексов в крови

27005 СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 9) д 4 С 01 Я 33/53 РЕТЕН ТЕЛЬСТ РСКОМУ аческийтральньнститу ЕЛЕОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ ОПИСАНИЕ(71) Всесоюзный кардиологиучный центр АМН СССР и Ценнаучно-исследовательский иэпидемиологии(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДНИЯ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ В КРОВИ(57) Изобретение относится к иммулогии, Цель изобретения - повьппе точности. Определяют содержание иммунных комплексов в сыворотке крови.Инкубируют исследуемую пробу с реагентом, содержащим субкомпонент комплемента С , Отделяют связавшиеся комплемент й фиксирующие иммунные комплексы и определяют их количества. Висходной сыворотке определяют уровеньне фиксирующих комплемент иммунныхкомплексов и общий уровень иммунныхкомплексов. По их разнице делают вывод о содержании иммунных комплексов,фиксирующих комплемент. Способ позволяет определить действительный уро"вень циркулирующих иммунных комплексов в крови,13270Изобретение относится к иммунологии, точнее к методам определения количества циркулирующих в крови иммунных комплексов (ЦНК).Цель изобретения - повышение точности путем одновременного определения фиксирующих и не фиксирующих комппемент иммунных комплексов (ИК) вкрови. 10Способ осуществляется следующим образом,Количественно определяют иммунныекомплексы в сыворотке крови, включающие инкубацию исследуемой пробы с реагентом, содержащим субкомпонент комплемента С 1 , отделяют связавшиесякомплемент фиксирующие иммунные комплексы и определяют их количества,причем исследуемую пробу инкубируют 20С эритроцитами, обработанными глутаровым альдегидом и связанными с субкомплементом С , в сыворотке, полученной после отделения комплементфикСирующих иммунных комплексов, и в исходной сыворотке с помощью лазернойкефелометрии определяют соответственно уровень содержания не фиксирующихкомплемент иммунных комплексов и общийуровень содержания иммунных комплексов, по разности которых делают заклю -чение о содержании иммунных комплекСов, фиксирующих комплемент,П р и м е р. Эритроциты человека0(1) группы, КЬ+, после тщательногоотмывания (до 10 раз) в изотоническом растворе (0,9 ) хлорида натриясуспенэируют в 0,25%-ном раствореглютаральдегида на том же иэотоническом растворе хлорида натрия, Суспензию инкубируют в течение 3 ч при37 С и затем вновь отмывают в изотопическом растворе. К одному объемуэритроцитов добавляют семь объемов0,25 -ного глютаральдегида и 0,01 . - 45ного азида натрия в изотоническомрастворе. Эритроциты в таком раствоаре хранятся в течение года при 4 С,Выделение С 1 проводили с помощьюзффинной хроматографйи на иммуйосорбенте из СИВг-активированной сефарозы 4 В, к которой ковалентно присоединяли 10 человека из расчета 30 мгна 1 мл сефарозы (2). На колонку с5 мп сорбента, уравновешенную 0,01 Мфосфатным буфером на О, 15 М хлориданатрия с 0,01 М ЭДТА, наносят 25 млчеловеческой плазмы (порциями по 5 мл)и элюируют тем же буфером со скоро 052стью 80 мл/ч. Колонку с сорбентомпромывают до полного исчезновения белка, после чего проводят элюцию 0,2 Мгексаметилендиамином. Элюаты диализуют против 0,3 М хлорида натрия втечение 24 ч при 4 ОС. В реакции двойной диффузии в агарозе с анти-С сыИвороткой Фракции исследуют на наличие С . Используемые условия позволяют йолучить 1,2 мг белка С 1 с концентрацией 200-300 мкг/мл. ПолученныйС 1 хранили при -45 С.Перед исследованием сывороток наналичие иммунных комплексов ех гешрогепроводят конъюгирование С с тест 1эритрбцитами (э ритроциты, обработанные глютаральдегидом). Для этого эритроциты тщательно отмывают в изотоническом растворе и к одному объемуосадка эритроцитов добавляют двадцать объемов раствора С (к 50 мкл1 сосадка добавляют 1 мл раствора С 10,2 мг/мл), Суспенэию тщательно встряхивают и инкубируют 2 ч при 37 С.После инкубации эритроциты отмываютот избытка С и к осадку эритроцитов, нагруженйых С добавляю пятьобъемов исследуемой сыворотки пациента (50 мкм + 250 мкл сыворотки),Сыворотку с конъюгатом С эритроцит инкубируют 30 мин при 37 С с периодическим потряхиванием каждые 57 кн. После инкубации эритроциты осаждают центрифугированием (2500 об,/мин)в течение 10 мин, надосадочную сыворотку отбирают для определенияуровня ЦИК, не связавшихся с С.ВЦсыворотке, не инкубированной с конъюгатом С 1 -эритроцит, определяют уровень всех ЦИК, а в сыворотке, проинкубированной с конъюгатом, определяют уровень не фиксирующих комплементЦИК.Определение проводят следующим об-разом, К 25 мкл сыворотки добавляют1 мл 3,5 .-ного раствора полиэтиленгликоля (ММ 6000) на изотоническомрастворе ИаС 1, смесь инкубируют привстряхивании в течение часа при комнатной температуре. В образцах измеряют степень светорассеяния на лазерном нефелометре нВепгдпя 1 пзг 1 гцге(кюветы объемом 1 мл, Л = 638 нм).Концентрацию ИК высчитывают по калибровочной кривой, полученной при измерении степени светорассеяния агрегированного 1 -глобулина - искусственного аналога ИК,27005 Формула изобретения Составитель В. ФроловаТехред И,Попович Корректор Л.Патай Редактор М, Петрова Заказ 3382/40 Тираж 776 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 13Применение нового реагента позволяет выделить ИК, фиксирующие комплемент, и обеспечить определение действительного уровня ЦИК (как фиксиру.ющих, так и не фиксирующих комплемент). Способ количественного определения иммунных комплексов в крови, включающий инкубацию исследуемой пробы с субкомпонентом комплемента С, фиксированного на эритроцитах, и осаждение комплементфиксирующих иммунных комплексов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точностипутем одновременного определенияфиксирунющх и не фиксирующих комплемент иммунных комплексов дополниЭтельно определяют содержание иммунных комплексов в сыворотке до инкубации с субкомпонентом комплемента Си после осаждения комплементфиксирующих иммунных комплексов, по разнице содержания между ними определяютколичество комплементфиксирующих иммунных комплексов, а по величинесодержания иммунных комплексов послеосаждения комплементфиксирующих иммунных комплексов определяют количество не фиксирующих комплемент иммунных комплексов.