Способ определения днк в клетках

(51 1 И 33/483 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ерно кий 79,Ии брете едназ е относи чено для я ДНК в дом протизобрет ельности утем уст итохи- ствен- микро- цитофлю- повыения флуоколич летка ного опрорганизм орометр делен ов ме и. Целвствит ния - преде анени ение ч НКвк етка СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Ленинградский институт ядфизики им. Б,П. Константинова(56) Ланда С.Б. Микробиология,т. 48, Ф 5, с. 939-942. 4) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ресценции не связанного с ДНК люминесцентного красителя, содержащего аминогруппу в хлороформной группировке. Для этого клетки Е, со 11 или Вас. зцЬсд 11 з фиксируют 703-ным этанолом 1 ч, затем центрифугируют 5 мин при 1500 у, Осадок промывают в дистиллированной воде и обрабатывают 1 ч раствором РНКазы (О, 1 Х раствор в трисбуфере рН 7,2 10 ммоль М 8 С 1,) при 37 С, Затем клетки подвергают кисо лотному гидролизу в 6 ННС 1 до полной депуринизации ДНК. Для раствора кра" сителя берут 1 О мг бромистого этидия на 100 мл воды, добавляют О, 1 мл хлоЬ ристого тионила. С учетом раствори- а мости 80 получают в растворе эквимолярные концентрации красителя и сернистого газа, 1 табл.Способ определения ДНК в клеткахпутем проведения кислотного гидро- лиза пробы с последующей обработкой гидролизата продуктом реакции флуорохрама с сернистым газом и измере нием флуоресценции, а т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, пробу перед кислотным гидрализам обрабатьпают растворам РНКазы, а в качестве 55 флуарахрама используют люминисцентныйкраситель, содержащий амнногруппу в хлароформной группировке, при этом краситель и сернистый газ берут в эквимолярных концентрациях,13173Изобретение относится к цитохимии, а именно к цитохимическим методам определения содержания ДНК, и наиболее эффективно ано может быть использовано для количественного определе ния ДНК в клетках микроорганизмов методом проточной цитофлюорометрии.Цель изобретения " повышение чувствительности определения ДНК в клетках путем устранения флуоресценции не 10 связанного с ДНК люминесцентного красителя, содержащего аминогруппу в хромофорной группировке.Способ осуществляют следующим образом. 15П р и м е р 1. Клетки бактерий Е. со 11 или Вас. зиЬг.111 з фиксировали 703-ным этанолом в течение 1 ч при комнатной температуре. После фик" сации клетки центрифугировали 5 мин 20 при 5000. Осадок промывали в дистиллированной воде и обрабатывали 1 ч раствором РНКазы (0,17-ный раствор в трис-буфере рН 7,2-10 мМ Мя 61 ) при 37 С, После обработки 25 РНКазой клетки подвергали кислотному гидролизу в 6 ИНС 1 при комнатной температуре до полной депуринизации ДНК, Для приготовления рабочего,раствора красителя брали 10 мг бромистого этидия на 100 мл воды. Непосредственно перед окраской к раствору красителя добавляли О, 1 мл хлористого тионила. Это количество с учетом растворимости БО позволяет получить в растворе эквймолярные концентрации красителя и сернистого газа. Указанные концентрации красителей и хлористого тионила быпи получены опытным путем при проверке зависимости интенсивности флюаресценции и коэффициента вариации от концентрации красителя и хлористого тионила.Влияние концентрации красителя и сернистого газа на интенсивность люминесценции и кеоэффициент вариации при окраске ДНК дрожжей предлагаемым способом приведено в таблице.Клетки окрашивали 1,5 ч при 4 С. После окраски клетки два раза промывали дистиллированной водой. Анализ количества ДНК проводили на установке ЛАСКАН.П р и м е р 2. Клетки СапаЫа а 1 Ь 1 сапз фиксировали смесью Карнуа (этанол:хлороформ:уксусная кислота в соотношении 6:3: 1) 1 ч при комнатной температуре. После фиксации клет 60 2ки промывали ристиллированнай водой и обрабатывали в растворе РНКазы (0,17-ный раствор в трис-буфере рН 7,2 + 10 ММ МдС 1) при 37 С, После этого клетки подвеогали кислотному гидролизу в 6 ИНС 1 да полной депуринизации ДНК. Рабочий раствор красителя готовили, как описано выше, Клетки окрашивали 1,5 ч при 4 С. После окраски клетки промывали два раза дистиллированной водой. Анализ ДНК проводили на установке ЛАСКАН.П р и м е р 3. Клетки млекопитающих (НеЕа/ фиксировали 707-ным этанолом с. двухкратнай сменой фиксатора 1 ч при комнатной температуре, После фиксации клетки промывали физиологическим раствором и подвергали кислотному гидрализу в 6 ИНС 1 до полной депуринизации ДНК, Перед гидрализом клетки обрабатывали раствором РНКазы, как описано выше. Рабочий раствор красителя готовили аналогично предыдущим примерам. Клетки окрашивали 2 ч при 4 С, После окраски клетки промывали два раза дистиллированной водой. Определение количества ДНК проводили на установке ЛАСКАН.Коэффициент вариации составлял 4,3%. При стандартной методике окраски коэффициент вариации составляет 6-87 Хотя различия в коэффициентах вариации при предлагаемом способе и при использовании стандартных методик и невелико, тем не менее применение предлагаемого способа предпочтительнее, так как он в отличие от стандартной методики является строго количественным, что тоже сказывается на точности измерений. Формула изобретения%4 Составитель Л. Сабурова Техред М.Ходанич Корректор А. Обручар Редактор А. Ренин Заказ 24 17/40 Тираж 776 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная,45 26 70 55 45 39 100 60 37 43 28 22 42 35 13 22 40 25 2.3 27