Способ трансдукции хромосомных маркеров и плазмид у yersinia реsтis

СОЮЗ СОВЕТСНИХсоциАлистичеснихРЕСПУБЛИК 9) (1 Б 15 ГОСУД АРСТ 8 ЕН по изоБРетени пРи Гннт сссР ОМИТЕТОтнРьтиям БРЕТЕНИЯ ИДЕП:ЛЬСТВ(54) СПОСОБ ТРАНСДУКЦИИ ХРОМОСОМНЫХМАРКЕРОВ И ПЛАЗМИД УУЕКЯТЯХА РЕБТ 18(57) Изобретение относится к бакте"риальной генетике, а именно к спосо ьтрацент ть пред- леток до И обла исключзациюэффект енно корганизкт ла мик ную т укции.- повьпп в с е часпосометодикется следующим е то ба.Это достигается путем использования фага Р 1 сш 1 с 1 г 100 йв р 1, который является производным фага Р 1 стп 1 с 1 г 100 з, способного размножаться на культуре чумного микроба в слое мягкого агара с образованием негативных колоний, что обеспечивает возможность: получать без дополнительного концентрирования препараты этого бактериофага, достигающие титлучают фаголи жения фага Р 1 мягкого агара оп. Т. рез 1 т.з т клетки реци ат в результат сш 1 с 1 г 1 ОО 1 з на культуре кл после чего об иенты этим лиз рамнслоеток штываю аом,Паысдукция аг ен я трансдуцирующего с 1 г 00 18 р 1 слиза аг Р 1 сш ОПИСАНИЕ К АВТОРСКОМУ СВ бретение относитсяиальной генетики, аи переноса геновпомощью трансдь изобретениярансдукции и упроще бам переноса генов микроорганизмовс помощью трансдукции, Цель изобретения - повышение частоты трансдукциии упрощение способа, Для этого используют Фаг Р 1 сш 1 с 1 г 100 йз р 1, являющийся производным Фага Р 1 стп 1 с 1 г100 йз, способного размножаться накультуре чумного микроба в слое мягкого агара на культуре клеток шоп,тегздпъа рез 1 з с образованием негативных колоний при обработке клетокреципиентов полученным лизатом. Этообеспечивает получение без дополнительного концентрирования препаратовэтого бактериофага, с титром .10 ф БОЕ/мл 1 исключение ультрацентрифугирования фага, исключение предварительной лизогенизации клеток донора; осуществление эффективнойтрансдукции по упрощенной методике. ра 10 п БОЕ/мл 1 исклюрифугирование фага;варительную лизогенинора и осуществлятьдукцию по упрощенноиСпособ осуществляобразом.титром 10 БОЕ/мл смешивают по 0,1 млс 18-часовой бульонной культуройУ, ревНя Е 776, которая не нуждаетсяв аргинине, выращенной при 28 С доконцентрации 10 м,кл/мл. Смесь инкуобируют при 37 25-30 мин и высеваютв 3 мл О,бй-ного агара,1,В которые затем выливают на поверхность 1,53 ного агара 1.В. Чашку инкубируют сут Ооки при 37 С, По окончании инкубацииверхний слой агара (О,бй-ного) собирают в центрифужную пробирку, добавляют 0,2 мл хлороформа, встряхивают втечение 3 мин, дают постоять при комнатной температуре 30 мин, Затем низкоскоростным центрифугированием(б 000 об/мин, 15 мин)осаждают агари остатки клеток, Надосадочную жидкость проверяют на стерильность высевом на питательный агар и в питательный бульон ЬВ, после чего используют как трансдуцирующий лизат, Титрполученного таким образом фага припроверке на газоне культуры У. рея1 я ЕЧ 76 обычно достигает 10 БОЕ/мл,3Для проведения трансдукции смешивают по 0,5 мл 18-часовой бульонной. культуры агя-зависимого реципиентаУ, рез 11.я Е 776 (экспоненциальная фаза 10роста) выращенной при 28 С и транс 1дуцирующего лизата (10 БОЕ/мл). Смесьинкубируют при 37 С 25-30 мин. Осаждают клетки центрифугированием(6000 об/мин, 15 мин) промывают физиологическим раствором и высевают наплотную агаровую среду И 9, содержащуюдобавки, необходимые для роста независимого от аргииина У.резйхя ЕЧ 76Контролем служи посев на эту жесреду культуры реципиента, обработанной также, как с,пытная проба, но бездобавления трансдуцирующего бактериофага, Посевы инкубируют при 28 С допоявления трансдуктантов (обычно 56 сут), Частота трансдукции хромосом"ных генов составляет 10 -10 /БОЕ. Наодной пластинке агара вырастает от 10до 100 трансдуктантов,П р и м е р 2. Трансдукция плазмиды КР 4.Трансдуцирующий лиэат готовяткак описано в предыдущем примере,используя в качестве донора культуруштамма У,резехз Е 776 (КР 4/ТсКшАрд)на которой размножают трансдуцирующий Фаг. Смешивают по 0,2 мл этоголизата (10 БОЕ/мл) и реципиентной18-часовой бульонной культуры штамма У,резйхз Оййеп вЕг, выращенной при28 С. После инкубации смеси при 37 Св течение 30 мин по 0,2 мл ее высевают на 1,5 Ж-ный агар 1.В с тетрациклином (12,5 мкг/мл). Контролем служат посевы фаголизата на стерильностьи бактерий реципиента на агаровуюсреду с тетрациклином, Выросшие колонии отсевают и после дополнительногорассева: на изолированные колонии проверяют по Ар" и Кт маркерам плаэмидыИР 4, Частота трансдукции составляет10, -10 /БОЕ,П р и м е р 3. Контрансдукциярго- и яца-генов,Трансдуцирующий лизат готовят какописано выше, размножая фаг на культуре донора У, реяС 1.я Ореп, прототрофного по пролину и гуанину 0,5 млполученного лизата (10 О БОЕ/мл) смешивают с 0,5 мл 18-часовой бульоннойкультуры реципиента У рея 1.я Ослепрго яца враг. После инкубации в течение 25-30 мин при 37 С клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин,15 мин), промывают физиологическимраствором и высевают на два вариантаминимального агара И 9 необходимымидля роста реципиентами, исключая водном варианте этой среды пролин, вдругом - гуанин, Посевы инкубирунтпри 28 С 5-6 сут, Сформировавшиесяна обеих селективных средах колониирассевают повторно на той же среде изатем по 2 выросшие колонии каждоготрансдуктанта отбирают для проверкиих зависимости от пролина и гуанина.80% колоний, выросших без пролина(частота их появления 10 /БОЕ) ненуждаются в гуанине, и наоборот, 807гуаниннезависимых трансдуктантов могут расти на среде без пролина, тоесть частота совместной передачи этихдвух маркеров составляет 807.,Использование во всех трех приемах Зйг " реципиентов при отсутствииэтого маркера у донорных бактерийпозволяет провести дополнительныйконтроль трансдукции: все трансдуктанты должны быть с этим маркером.Для экспериментов по трансдукции у У. рез 11 з могут быть использованы как среды импортного производства на основе дрожжевого экстракта и пептона Фирмы "Эхйсо" (например,агар 1.В), так и отечественные качественных серий (типа агара Хоттигера).В качестве минимальной среды приме,1304406 Формула изобретения Составитель Н,КузенковаРедактор Х,Васильева Техред М,Ходанич Корректор Т.Малец Заказ 992 Тираж 491 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по издбретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 няют агар М 9, в общеизвестную основусреды М 9 добавляют до 1,57 агар-агараИВхЕсо или высокоочищенного качественного отечественного агар-агара и5для обеспечения роста бактерий У,резз на 100 мл среды - 0,2 107-ногораствора серно-кислого магния,0,5 мл207.-ного раствора серно-кислого аммония, 0,5 г сульфита натрия, разведенного в 2 мл дистиллированной воды, и0,4 мл 407-ного раствора глюкозы, атакже фенилал и метионин в количестве0,1 мл 0,1 Е-ного раствора, по которым бактерии штаммов ЕЧ 76 и Ойеп являются природными ауксотрофами,Трансдукцию с помощью бактериофага Р 1 сш 1 с 1 г 100 з р 1 можно эффективно проводить с любыми штаммамичумного микроба.Время, затрачиваемое на проведение трансдукции, не превьппает 24 ч,что в 3-5 раз быстрее, чем при использовании ранее применяемых фагов.Появляется возможность проведения одновременного множества опытов по трансдукции, используя в одном экс- . перименте несколько доноров и реципиентов, а не 1-2, как это позволяет принятая в практике для У.рез 1 дз методика. Наконец, на пластинках селективных сред вырастает на 1-2 порядка большее количество трансдуктов, что способствует более эффективному сбору и анализу трансдуктантов при работах по контрансдукции, а также интенсификации работ по конструированию нужных для экспериментов штаммов.с Способ трансдукции хромосомных мар" керов и плазмид у Уегзжда резйз путем обработки клеток реципиентов фаголизатом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с, . целью повьппения час" тоты трансдукции и упрощения способа, лизат получают из фагов Р 1 сш 1 с 1 г 100 йз р 1, выращенных в слое мягкого агара на культуре клеток У.резс 1 з.