Штамм бактерий рsеudомоnаs sp., осуществляющий полное разложение метилацетата

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ 16859 ЕСПУБЛИК О,С 02 РЗ/ 1)5 С 12 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ВИДЕТЕЛЬСТВУ КО В экспери.: Химия,л Изоб технологи стке сточн бактерий при биоло тальдегид О О новогоособноксусной й синте- ойчивый лиэованм путем иях. ТаГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Институт микробиологии и вирусологии АН КазССР (72) Д,Ю.Раков, Н.В.Доронина, Ю,А.Троценко и Р.М,Алиева(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ РЯЕОООМОМАЯ ЯР, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ ПОЛНОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ МЕТИЛАЦЕТАТА ретение относится к области биои, в частности биологической очиых вод, и касается нового штамма который может быть использован гической очистке сточных вод аценого производства,Цель изобретения - получение штамма бактерий, обладающего сп стью утилизировать метилацетат. Метилацетат (метиловый эфир у кислоты) - летучий, высокотоксичны тический поллютант, химически уст при нормальных условиях. Металацетат может быть гидро до ацетата и метанола химически при нагревании в щелочных услов(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства. Штамм Рзеобоптопаз зр, ВКМ ВД выделен из сточных вод ацетальдегидного производства в Казахской ССР. Штамм способен полностью разлагать метилацетат при его концентрации 0,1-6 г/л, за 5 - 8 ч, после предварительной адаптации не менее 3 пассажей на среде с метилацетатом, используя продукты его гидролиза - метанол и ацетат в качестве источников углерода и энергии.1 табл. ким образом, при омылении метилацетата необходимы большие количества щелочи, что усугубляется низкой кислотностью стока ацетальдегидного производства (рН 3 - 4), и постоянное нагревание реактора (для отгонки метанола и смещения реакции в сторону разложения металацетата), В экп;огическом плане подобная очистка малоэффективна, поскольку образуется токсичный метанол, Создание дополнительных реакторов требует значительных капиталовложений,Микробиологическая очистка имеет по сравнению с известным методом ряд пре- имуществ: полная утилизация метилацетата бактериями - деструкторами в локальном стоке и меньшие энергозатраты.5 10 15 20 5,0 0,2 0,004 Выделен штамм Рзецдогпопоз зр.278 О, полностью разлагающий метилацетат. Штамм выделен из сточных вод ацетальдегидного производства. Штамм полностью разлагает метилацетат, используя его в качестве источника углерода и энергии. Штамм имеет следующие культурально- морфологические и физиолого-биохимические свойства..Культурально-морфологические признаки.Клетки - бесцветные подвижные палочки 0,5 - 0,8 х 1,5-2,5 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные, неспорообразующие, не имеющие сложных внутрицитоплазматических мембран, подобных метанотрофным бакгериям. Не образует простек, Размножается путем деления пополам, Колонии на МГА до 4 мм в диаметре, округлые, с ровным краем, непрозрачные, белые, слизистые, поверхность гладкая, профиль выпуклый, структура однородная, консистенция маслянистая,Среды для выращивания: мясо-пептонный бульон (агар), синтетическая среда Д (пример 1) с метилацетатом, глюкоза-картофельный агар,Физиолого-биохимические признаки, Аэроб, расчет при температуре от 10 до 41 С, оптимум 28-32 С. Оптимум рН 6,8 - 7,2, при рН 3,6 не растет, Флуоресцирующие пигменты, пиоциэнин, каротиноиды не образует. Имеет аргининдигидролазу, ката- лазу, образует индол., Оксидазная реакция отрицательная. Нитраты восстанавливает в нитриты, Леван иэ сахарозы, ацетоин не образует. Желатин, целлюлозу. поли- р-оксибутират, твинне разлагает, но гидролизует крахмал. Г 1 оли- Р-оксибутират внутриклеточно не накапливает, 01:Р-оксибутират не использует в качестве источника углерода в недостаточной по азоту среде, В качестве источника углерода для роста использует: метанол, этанол, мезо-инозит, метилацетат, этилацетатбутилацетат, глюкозу, трегалозу,"арабинозу, фруктозу, 1:рамнозу, О-рибозу, О-ксилозу, сахарозу, ацетат, фумарат, сукцинат, а-кетоглутарат, 01-валин, О-серин, О.-аргинин.Среду с глюкозой подкисляет, газообразование отсутствует. Рост не обеспечивает формальдегид, формиат, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, бетаин, саркозин, этилформиат, изопропанол, изобутанол, ф -аланин,-серин, фенилаланин, глиоксилат, п-оксибензоат, ггп-оксибензоэт, Анаэробно не ферменти 25 30 35 40 45 50 55 рует глюкозу, Не растет автотрофно в атмосфере С 02+ Н 2+ 02,В качестве источника азота использует соли аммония, нитраты и некоторые аминокислоты. В ростовых факторах не нуждается. Т,пл, - 61,8,Штамм обладает карбоксилэстеразой, катализирующей гидролиз эфирной связи метилацетата с образованием метанола и ацетата. Ацетат ассимилирует через цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт (изоцитратлиазу ималатсинтазу), Метанол использует через фруктоэобисфосфатальдолазный вариант рибулоэомонофосфатного цикла фиксации формальдегида. Карбоксилэстераза, дегидрогенаэы метанола (ФМС), формиата (ФМС), формальдегида (НАД) и гексулозофосфатсинтаза индуцибельны. Оксипируватредуктаза и рибулоэобисфосфаткарбоксилаза отсутствует. Штамм является факультативным метил отрофом,Условия хранения штамма.Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии, защитная среда - молоко, При этом свойства штамма устойчивы, В лабораторных условиях культура поддерживается на косяках с МПА и пересевается через 2 нед,Поскольку ферменты, ответственные за деградацию метилацетата, индуцибельные, существенные отличия наблюдаются при использовании этого субстрата адаптированной и неадаптированной культурой. Адаптированная культура Рзецсовопэз зр. ВКМ ВД осуществляет полное разложение метилацетата при его концентрациях от 0,1 до б г/л за 5-48 ч соответственно (таблица 1),В стоках ацетальдегидного производства содержится около 0,15 - 0,20 г/л метилацетата, однако при залповых выбросах концентрация этого соединения может достигать 1,0 - 2,0 г/л.П р и м е р 1, Использование метилацетата неадаптированной культурой.Культуру Рзецбовопаз зр. 27 н 0 (ВКМ ВД) выращивают на МПА в течение суток. Суспензию выросшей культуры (неадаптированной) высевают в колбы на 750 мл со 100 мл среды следующего состава, г/л дистиллированной воды;1685995 Составитель И.Болотинаедактор Н.Яцола Техред М,Моргентал орректор Т.Малец каз 3576 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушсквя наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 1 Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин, метилацетат вносят в колбу в концентрации 2 г/л и после засева закрывают резиновой пробкой для предотвращения испарения метилацетата.Культуру выращивают на качалке при 180 об/мин при 29 С, Контроль за процессом деградации метилацетата осуществляют хроматографически. Колонка (70 см;9-2 мм) заполнена Порапаком О, скорость Н 230 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, Й 2-30 мл/мин, Температура колонки 110 С. Ацетат определяют на газовом хроматографе. Колонка (1,8 м; ,Омм), заполнена Порапаком ОЯ. Скорость Нг 35 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, И 35 мл/мин, Температура колонки 160 С.Процесс разложения метилацетата неадаптированной культурой начинается только через 4 сут, Содержание метилацотата по данным газовой хроматографии через 43 сут составляет 93; от исходного, через 5 сут 75, через 6 сут 25;, через 7 сут метилацетат и продукты его гидролиза - метанол и ацетат в среде не обнаруживается. Период активной деградации метилацетата совпадает с активным приростом биомассы.П р и м е р 2. Использование метилацетата адаптированной культурой.30 мл суспензии, выросшей на среде с метилацетатом двухсуточной культуры Рвецбогпопаз зр. 27 КО (адаптированной, не менее 3 пассажей на среде с метилацетатом), высевают в колбы на 750 мл со 100 мл среды, описанной в примере 1.В качестве источника углерода в энергии вносят 2 г/л метилацетата, Количествен ный газохроматографический анализкультуральной жидкости на содержание метилацетата, метанола и ацетата проводят через каждый 3 ч в течение 24 ч культивирования. К 6 ч культивирования в среде накап ливается около 0,015 г/л метанола, которыйполностью исчезнет к 21 ч. Ацетат отсутствует в течение всего периода культивирования. К 12 ч содержание метилацетата в среде составляет 157 ь от исходного. Анализ 15 культуральной жидкости через 24 ч свидетельствует о полном использовании метилацетата.Таким образом, штамм Рзенбовопазз р. 27 ВО (В КМ ВД) обладает способно стью полностью разлагать метилацетат приего концентрации до 6 г/л, используя продукты его гидролиэа ацетат и метанол в качестве источников углерода и энергии, что обеспечивает возможность использования 25 данного штамма при очистке промышленных сточных вод ацетальдегидного производства. Формула изобретения 30 Штамм бактерий Рзеобопопаз зр, ВКМВД, осуществляющий полное разложение метилацетата,