Способ определения пероксидазы

1285374 1 аблица 1 Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, химической, пищевой и фармацевтической промышленностях, например, для определения ферментативной активности гем-содержащих веществ и биологических препаратов.Цель изобретения - упрощение способа определения пероксидазы.ЮСпособ осуществляют следующим образом.Готовят различные концентрации пероксидаэы на постоянном фоне пере 15 киси водорода в натрий-ацетатном буфере рН 3,8. На смоченную дистиллированной водой или буфером эмульсионную поверхность иодид серебряной фотопластинки в темноте с помощью автоматического микродозатора наносят пероксидазосодержащие растворы. Через определенный промежуток времени в зависимости от ожидаемой концентрации пероксидазы фотопластинку проявляют, закрепляют, сушат. Количественную оценку пероксидазы осуществляют путем микрофотометрирования .пятен на фотопластинке и сопосИнтенсивность почернений С еероксиддОб онцентацияероксиазы,нг/ иссле 5 довани 4,10000 е опредеяется 22 5000 218(фон) 12 авления данных с градуированным графиком,П р и м е р 1. Для построения градуировочного графика для определения пероксидаэы на эмульсионную поверхность фотопластинки "Шоп 1 Я" с помощью автоматической микропипетки наносят по 50 мкл пероксидазосодержащих растворов, полученных путем последовательного разведения исходного раствора пероксидаэы хрена (ВЕ 0,6 "Кеапа 1") на фоне 0,1 М натрий ацетатного буфера (рН 3,8), содержащим 1 мМоль перекиси водорода, Диапазон определяемых содержаний пероксидаэы (шкала) содержит 0,01 - 10,0 кг/мп пероксидаэы.Пластину оставляют в темноте на 10 ч. Затем, стряхнув капли раствора ее проявляют. Полученные на месте контактирования с пероксидаэосодержащим раствором пятна фотометрируют на микрофотометре МФ, используя шкалу почернений. Строят градуировоч ный график в координатах 8 пероксказы почернение КоэфФициент вариации определения не более 10 ь. Результаты определения пертоксидаэы приведены в табл.1. 35П р и м е р 2. Несколько кристалликов лиофилизированного иммунопероксидазного конъюгата для иммуноферментного анализа: аспарагиназа -пера40 оксидаэа и иммуноглобулин 6 ослапротив иммуноглобулина С кролика ме-ченый пероксидазой (соответственноконъюгат для прямого конкурентйогоиммуноферментного анализа и иммуно ферментного анализа с использованиемвторых антител) растворяют в физиологическом растворе. Концентрацию бел"ка определяют на спектрометре с использованием номограмм при= 260 нм и= 280 нм. Концентрациюпероксидазы рассчитывают по формулеС = 0,44 мг/мл при ф = .403 нм. Полу"ченные растворы разбавляют 0,001 М раствором Н О,приготовленным в О,1 Мнатрий-ацетатном буфере рН 3,8, Раэведения проводят в лунках полистироловых микроплат для проведения иммунологических реакций, получая по 12разведений (максимальное - в 204812853 раз). В соседний ряд лунок заливают стандартные концентрации нативнойпероксидаэы. Производят оценку годности конъюгатов, сравнивая его активность с активностью нативной пероксидазы . по эффекту на фотопластинках, Результаты определения пероксидазы в конъюгатах для иммуноферментного анализа представлены в табл.2,РасчетПро"центактивстиная конная ентрация перксидазы, г/мл концентрацияпероксидазы при=. 403 нм,нг/мп Образец ности. Конъюга раиназа-пероксй 1,6,2 окисление, проале, содержащем концентрацию и по интенсивМосго фотомате иал одят наиодистоероксидаэыи засветкиа послеавлении с тени ксидаэы ного оки дорода с Ф 4 Способтем проведления иодипо следующнтатов, очто с цел ных резульй с я тем, оба, ферния при соп ст чным графиком. и о о ставитель Е . Воробьеехред И.Попович г рректор М актор А.Саб орская Тираж 7 8/46 ВНИИПИ по 11303Подписное аказ Государственного комитета СССелам изобретений и открытийМосква, Ж, Раущская наб.,д.4/5 Произ дственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4 ла изобре определения перо ения ферментатив дов перекисью во м учетом получент л и ч а ю щ ью упрощения сп с Концентрация белка= 280 нм,мг/мп 74 4В четырех образцах конъюгат имеет удовлетворительную активность, в одном - неудовлетворительную (27) и не может быть использован. в иммуноферментном анализе.Таким образом, не уступая известным способам по показателям чувствительности и точности, предлагаемый является способом более простым.фТ аблица 2 ментативно фотоматери серебро, а определяют используем его проявл градуирово