Способ определения активности амилазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК ПИСАНИ ТЕНИ ОБ ТЕЛ ЬСТВ К АВТОРСКОМ(57) Иэохимическжет бытьхромогеннии акти,ретения ние от рейис ится к физико- медицине и модля получения ологиильзованубстра ов при определезы. Целью изобличение чувствиности амил вляется ув ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Институт химической и биологической физики АН ЭССР и Опытный завод органического синтеза и биопре.паратов Института химии АН ЭССР(56) Степаненко Б.И. Введение в химию и технологию органических красителей, М,: Химия, 1977, с.190-19.Патент ФРГ В 1940869,кл. С 08 С 19/04, 1978. Б ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТ 801285373 4 с О и 33/548// С 2 н 9/32 тельности и сокращение времени анализа. Картофельный крахмал подвергают набуханию в воде при 65-70 С с пос" ледующей обработкой красителем при концентрации щелочи 0,01-0,05 моль/л(рН 2) при температуре 45 - 50 С в течение 1 ч. Окрашенные гранулы крахмалаудаляют из реакционной смеси центрифугированием, промывают водой и еще раз центрифугируют, Полученную густую массу пропитывают раствором, содержащим хлористый натрий и компоненты фосфатного буфера (рН 7,2) и высушивают лиофильно. В качестве красителя используют дихлорО триазимовый активный ярко-голубой КХ. Ж Предварительное набухание крахмала в узком интервале температур и проведение обработки набухшего крахмала при низком содержании электролитов позволяет при помощи отечественного ярко-голубого красителя КХ получить высокоактивный субстрат для определения активности амилазы. 3 табл, 12853И обретегпге относится к способамгголучения хромогенных субстратов ипреимущественно может быть использовано в физико-химической биологиии медицине для определения активности амилазы,Цель изобретения - увеличениечувствительности и сокращение времени анализа,Способ осуществляют следующим образом.Картофельный крахмал подвергаютнабуханию в воде при 65-70 С, а обработку набухшего крахмала красителемпроводят при концентрации щелочи0,01 - 0,05 моль/л (рН 12) при 4550 С в течение 1 ч. Окрашенные гранулы крахмала удаляют из реакционной смеси центрифугированием, промывают водой и еще раз центрифугируют.Полученную густую массу пропитываютраствором, содержащим хлористый нат- .рий и компоненты фосфатного буфера(РН 7,2 и высушивают лиофильно. 25В качестве красителя используют дихлортриазимовый активный ярко-голубой КХ. Предварительное набуханиекрахмала в узком интервале температур и проведение обработки набухшего крахмала при низком содержании.электролитов позволяет при помощиотечественного ярко-голубого красителя КХ получить высокоактивный субстрат для определения активности35амил азы.П р и м е р 1. 20 г картофельногокрахмала суспендируют при комна-.нойтемпературе в 1 л дистиллированнойводы. Набухание суспендированного 40крахмала проводят при постоянном перемешивании при 67 С в течение 20 мин.оСуспенэию охлаждают до 48 С и прибавляют 5 г активного ярко-голубогокрасителя КХ, растворенного в 200 мл 450,02 М фосфатного буфера (рН 9). Через 15 мин к реакционной смеси прибавляют 5 мл 2 н. раствора ИаОН.рНсуспензии повышается при этом до 12(концентрация ИаОН составляет приэтом 0,01 М). Продолжительность реакции прн постоянном перемешиванииои при 48 составляет 1 ч. Гранулыкрахмала выделяют из реакционной среды 15-минутным центрифугированиемпри 3000 об/мин, промывают водой иснова центрифугируют, Полученнуюгустую массу гранул крахмала суспендируют в 200 мл раствора, .содержаще 73 2го 5,32 г ля Н 1 О12 Н О и 6,57 г ВаС 1. Полученную суспензию высушивают лиофильно н получают 25 г синего порошка. Полученный окрашенный субстрат используют для определения активности амилаэы. В пробирках взвешивают по 40 мг окрашенного крахмала н прибавляют 2,3 мл дистиллированной воды. Суспензию термостатируют 5 мин при 37 С и прибавляют в каждую пробирку 0,2 мл раствора пг, -амнлазы, содержащего 0 - 3,75 мг/л ферментного препарата фирмы Мегс 1 с активностью 277 международных единиц на 1 мгПродолжительность реакциио15 мин при 37 С. Реакцию останавливают прибавлением 0,5 мл 1,0 М раствора соляной кислоты. Реакционную смесь центрифугируют в течение,3 минпри 1600 об/мин и определяют оптическую плотность центрифугата на однолучевом спектрофотометре Яресо 1 21 при 620 нм. Оптическая плотность по отношению к пробе С нулевым содержанием а -амилазы прямо пропорционально зависит от количества ферментного препарата в растворе, в котором проводится его определение (см.табл.1) .В скобках при количестве прибавляемого фермента также приведена активность в международных единицах, которая получается в результате умножения количества прибавляемого ферментного препарата в 1 л раствора на его первоначальную активность (см.табл.1).для определения активности оГ -амилазы определенное количество окрашенного крахмального порошка суспендируют в воде, термостатируют и прибавляют пробу., содержащуюся -амилазу,инкубируют при постоянной температуре, отделяют непрореагировавший крахмал и фотометрически определяют оптическую плотность при 620 нм, По калибровочной кривой или по формуле,А = ЬПК, где А - активностьсг, -амилазы в исследуемой жидкости, Е/л; Юб - оптическая плотность пробы при 620 нм по отношению к пробе с нулевым содержанием Ы -амилаэы; К переходный коэффициент, который характеризует реакционную способность хромогенного субстрата и определяется при помощи стандарта с известной активностью, рассчитывают активность ог-амилазы в исследуемом растворе.12853 Проводят сравнение реакционнойспособности субстрата, полученногопо предлагаемому способу, с общеизвестными таблетками "РЬайеЬав" фирмыРпагаас 1 а для определения активности п -амилазы в сыворотке крови человека.Определение активности п 6 -амилазыв сыворотке при помощи таблеток "РЬайеЬаз" проводят по методике Фирмы. 10В пробирки помещают 4 мл дистиллированной воды и прибайляют одну таблетку, которая набухает в воде. Полученную суспензию термостатируют в течение 5 мин при 37 оС, прибавляют0,2 мл сыворотки крови человека,встряхивают и термостатируют 15 минопри 37 С. Реакцию останавливали прибавлением 1,0 мл 0,5 И раствора гидроокиси натрия. Реакционную смесь 20центрифугируют 5 мин при 1600 об/мини определяют оптическую плотностьпри 620 нм. Активность ос -амилазы всыворотке в.международных единицахна 1 л сыворотки (Е/л) находят покалибровочной кривой,Определения с окрашенным крахмалом,полученным по предлагаемому способу, проводят по указанной методике.Вместо раствора с 6 -амилазы прибавля 30ют 0,2 мл сыворотки. Активность павамилазы (А) в международных единицахна 1 л сыворотки рассчитывают по формуле:.А = АЭыо К, где АПбо оптическая плотность пробы по отношению к пробе с нулевым содержаниемы,-амилазы при 620 нм;К - константа, характеризующаяреакционную способность хромогенного субстрата с о 6 -амилазой, которая40определяется по методике примера 2при помощи стандарта о 6-амилазы с известной активностью. В данном случаеК = 954. Полученные результаты при.ведены в табл.2.П р и м е р 2. Приводятся экспериментальные данные, показывающие влияние солей и условий набухания крахмала на реакционную способность полученного хромогенного субстрата.20 г картофельного крахмала суспендируют при комнатной температуре в 1 л дистиллированной воды. Набухание суспендированного крахмала про водят при постоянном перемешивании .при 67 С. Температурный промежуток, в котором возможно проводить набуохание, 65-70 С. Так как промежуток 73 4маленький, опыты праводяч ся при средонем значении 67 . При температуреовьпце 70 крахмал становится слишкомнабухшим, сниженным, что затрудняетдальнейшую обработку крахмала красителем, а лри температуре ниже 65ополного набухания не происходит иполучают малоактивный препарат. После набухания суспензию охлаждают до50 С и разделяют на четыре порцииопо 250 мл,Первую порцию окрашивают по примеру 1, прибавляя 1,25 г активногоярко-голубого красителя КХ, растворенного в 50 мл 0,02.М ФосфатногобуФера. рН доводят до 12 прибавлением 1,25 мл 2 н.раствора БаОН (концентрация БаОН составляет при этом0,05 М).Вторую порцию окрашивают прибавлением 1,25 г этого же красителя,растворенного в 50 мл дистиллированной воды, а рН доводят до 12 прибавлением 2 н.НаОН, постоянно проверяярН смеси рН-метром,Третью порцию окрашивают прибавлением 1,25 г этого же красителя,растворенного в 40 мл дистиллированной воды; рН суспенэии переводят вщелочную область прибавлением 10 мл1,5 М раствора Ба РО 4 .В четвертую порцию прибавляют1,25 г этого же красителя, растворенного в 40 мл дистиллированной во- .ды, и 28 г безводного На 80 . рНсуспензии переводят в щелочную область прибавлением 1 О мл 1,5 Мраствора НаРО.Пятый и шестой образцы получаютнабуханием 10 г картофельного крахмала в 500 мл дистиллированной водыпри постоянном перемешивании прио50 С в течение 1 ч. Суспензию разделяют на две порции по 250 мл.Пятый образец подвергают окрашиваниюпо методике первой порции,а шестой - по методике четвертойпорции. Во всех случаях окрашивание, проводят при постоянном перемешиваниирпри 50 С в течение 1 ч. Гранулы крахмала выделяют иэ реакционной среды центрифугированием, прожвают водой и снова центрифугируют,Все образцы, полученные в виде густой массы, суспендируют в 50 мл раствора, содержащего 1,33 г Ба, НРО хх 12 Н О и 1,65 г БаС 1, рН суспензий(623) 416) 0,22 0,43 0,65 0,89 1,08 Таблица 2. 0,31 0,20 Оэ 495 4 34 0,9 0,555, 530 0,582 555 980 12 2,95 80 0,226 5 128537 доводят до 7,2 добавлением 2 М раствора НС 1, Полученные суспензии высушивают лиофильно в лиофилизаторе.Качество полученного окрашенного .крахмала как субстрата для определения ферментативной активности Ы -амилазы характеризует скорость его гид" ролиза под действием фермента,Определение ферментативной активности проводят по примеру 1, прибавляя в Ю пробирки по 40 мкг препарата К -амилазы, Полученные результаты приведены в табл.3, где дР о прямо пропорциональна скорости ферментативного гидролиза. 15Из приведенНого примера видно,что повыпение коицентрации солей в растворе окрашивания и особенно понижение температуры набухания крахмала приводят к понижению реакционной спо собности синтезированного субстрата..Таким обраэоМ, использование красителя с двумя активными группами по сравнению. с известным спдсобом, в котором используется краситель с одной активной группой, и проведение окрашивания набухшего при 65-70 С крахмала при концентрации щелочи 0,01"0,05 моль/л при отсутствии посторонних электролитов в отличди от ЗО Концентрация 1 активность) 0,75ферментного препарата,мг,1 (Е/л)(208) Оптическая плотность при620 нм 3 бизвестного способа, в котором процесс проводят без предварительногонабухания и в присутствиисульфатанатрия (до 107-й концентрации) позволяет сделать вывод, что при использовании предлагаемого способа увеличивается чувствительность и сокращается время анализа при определенииактивности амилазы. Формула изобретения- Способ определения активности амилазы, предусматривающий получение хромогенного субстрата путем обработки крахмала активным красителем в щелочной среде, промывание и высушивание окрашенного крахмапа, смешивание его с раствором амилазы и анапиэ полученного раствора, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения чувствительности и сокращения времени анализа, крахмал перед обработкой активным красителем подвергают набуханию в воде при 65-70 С, при" чем в качестве красителя используют ярко-голубой КХ, а обработку крахмала красителем ведут при температу" ре от 45 до 50 С и концентрации ще.олочи от 0,01 до 0,05 моль/л.Т аблиц а 11285373 Та блица 3 Концентрация, г/л, фосфата в виде Т ТемпеОбразец ратура набухания,С БаРОй Баг 804 Ь Рбго 0,75 0,55 О 67 О. 0,77 0 0,55 0 67 0,06 93,3 8,25 67 0 0 0,55 50. 50 0 93,3 Составитель А.СиницынТехред И.ПоповичКорректор М.Демчик Редактор А.Сабо Тираж 776 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий4113035, Москва, Ж, Раушская наб д.4/5 Заказ 7638/46