Способ обнаружения антигенов энтеробактерий

-14 Бюл. Вследова льский инст обиологии и лезнеиа и В.А,Шамар8,8) видетельство С ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ(21) 3796039/28 (22) 26.09.84 (46) 30.11.86. (71) Научно-ис тут эпидемиолог инфекционных бо (72) М.Ю.Суслов (53) 615.373(08 (56) Авторское В 843953, 1981(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВЭНТЕРОБАКТЕРИИ(57) Изобретение относится к медици.не. Цель изобретения - повышение специфичности и чувствительности анализа антигенов энтеробактерий. Исследуемую пробу фекалий заливают раствором МаС 1, эмульгируют, отмывают, прогревают и центрифугируют. Часть надосадочной жидкости отбирают для исследования с помощью реакции пассивной гемагглютинации. Оставшуюся частьэмульгируют и смешивают с равным объемом антисыворотки. После экспозициипробу центрифугируют. Надосадок исследуют с помощью реакции торможенияпассивной гемагглютинации.12731 10 20 30 40 Изобретение относится к медицине, в частности к серологической диагностике.Цель изобретения - повышение специфичности и чувствительности анализа антигена энтеробактерий в фекалиях с помощью эритроцитарных диагностикумов.Указанная цель достигается тем, что до кипячения исследуемый образец трижды отмывают физиологическим раствором, затем образец кипятят, отделяют надосадок и используют,цля анализа в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), а осадок исследуют с антимикробными сыворотками в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).Постановка РТПГА.по известному способу включает агглютинацию диагностикума антисывороткой в заранее подобранной (2-4 гемагглютинирующие единицы) и проконтролированной рабочей дозе, истощенной надосадком Фекалий.Использование отмытого осадка существенно повышает специфичность и чувствительность РТПГА.Для постановки РПГА по предлагаемому способу используют супернатант, полученный путем центрифугирования предварительно отмытого, эмульгированного и кипяченого осадка Фекалий. Это позволяет существенно повысить специфичность РПГА, а значит, и точность серологического анализа.Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.Исследуемую пробу фекалий заливают 085 %-ным раствором МаС 1 (5-10 объемов), эмульгируют и двух-трех- кратно отмывают свежими порциями 0,85 %-ного раствора ИаС 1 и прогревают в кипящей водяной бане в течение 60-90 мин, после чего центрифугируют. Часть надосадочной жидкости отбирают для исследования с помощью РПГА а оставшуюся часть эмульгируют и смешивают с равным объемом антисыворотки в стандартном разведении. После 30-60 мин экспозиции пробу центрифугируют и надосадок исследуют с помощью РТПГА. П р и м е р, При обследованиибольного на дизентерию проведен поиск в фекалиях антигенов шигелл 6специфичностей (флекснера, Бонне,Ньюкасла, Штуцера - Шмитца, Григорье 14 2ва - Шига и Ларди-Сакса) по извесгному и предлагаемому способам. По известному способу фекалии заливают 10 объемами 0,85 7-ного раствора МаС 1, прогревают в кипящей водяной бане 60 мин, центрифугируют иисследуют надосадок с помощью РПГАи РТПГА.По предлагаемому способу Фекалиизаливают произвольным объемом 0,85 %ного раствора ИаС 1, эмульгируют (перемешивают стеклянной палочкой) иотмывают дважды свежими порциями0,85 %-ного раствора ИаС путем центрифугирования при 3500 об/мин в течение 15 мин. После этого к осадку добавляют 5-кратный объем 0,85 %-ногораствора МаС 1, эмульгируют, прогревают в кипящей водяной бане 60 мини центрифугируют при 3500 об/мин15 мин. Затем 0,5 мл супернатанта отбирают для исследования с помощьюРПГА, для чего в планшете микротитратора готовят 6 одинаковых рядовпоследовательных разведений супернатанта в объеме 0,05 мл на 0,85 %-номрастворе ИаС 1, содержащем 0,4 7 нормальной лошадиной сыворотки, рН 7,07,2, и вносят в каждый ряд определенный антигенный диагностикум в объеме0,025 мл. Учет РПГА по обычной методике через 1,5-2 ч.Остаток пробы эмульгируют, вносятв нее равный объем смеси шигеллезныхсывороток 6 специфичностей (конечноеразведение каждой сыворотки в неадсорбированной смеси 1:100, в адсорбированной смеси 1:25) и выдерживают 40 мин при комнатной температуре, Затем пробы центрифугируют при 3500 об/мин в течение 15 мин, отбирают 0,5 мл супернатанта и исследуют с помощью РТПГА.1Для этого готовят в планшете микротитратора 6 одинаковых последовательно разведенных рядов супернатанта в объеме 0,05 мл на 0,85 %-ном растворе МаС 1. Для постановки контроля к 0,5 мл исходной смеси сывороток добавляют равный объем 0,85 7- ного раствора ИаС 1 и готовят 6 рядов разведений смеси антисывороток. В каждый ряд (1 опытный и 1 контрольный) вносят по 0,025 мл определенного 0,5 7-ного антигенного диагностикума, Учет через 1,5-2 ч по обычной схеме для РТПГА. Присутствие антиге114 Составитель Л.ПадюковТехред, Л. Сердюкова Редактор И.Рыбченко Корректор Е.Рошко Заказ 6365/6 Тираж 660ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 1273 на устанавливают по степени истощения гомологичной антисыворотки.В результате при обнаружении анти- генов различных видов шигелл с помощью РПГА по известному способу идентифицировано 17 образцов (42 7), с помощью РТПГА - 14 образцов (34 7), по предлагаемому способу - 23 и 37 (56 и 90 Е) соответственно.Предлагаемый способ позволяет знаО чительно повысить специфичность анализа за счет удаления активных растворимых агентов и повысить чувствительность индикации для многоэтапных реакций (РТПГА). Предлагаемая модификация РТПГА, когда истощение сыворотки идет за счет суммы растворимого антигена и микробных клеток, присутствующих в осадке фекалий, позволила в ряде случаев превысить порог инди кации, характЕрный даже для антигенных диагностикумов и в целом повысить результативность серологического анализа.Таким образом, предлагаемый спо соб обнаружения антигена с помощью эритроцитарных диагностикумов позволяет значительно повысить точностьсерологического анализа (на 15-60 7)за счет повышения специфичности (дляРПГА и РТПГА) и чувствительности(для РТПГА) индикации антигена. Значительные затраты времени на отмывание осадка фекалий (30-40 мин) компенсируются снижением затрат трудаи времени на выбор и контроль дозантисыворотки для нейтрализации поизвестному способу (3-3,5 ч),Формула изобретенияСпособ обнаружения антигенов энтеробактерий путем исследования в реакции пассивной гемагглютинации супернатанта, полученного после кипячения образца фекалий и центрифугирования, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности анализа, до кипячения образец отмывают физиологическим раствором, а после отделения супернатанта осадок фекалий дополнительно исследуют в реакции торможения пассивной гемагглютинации антимикробными сыворотками.