Способ определения кальция в биологической жидкости

СОЮЗ СОВЕТСНИХсоциАлистичесни кРЕСПУБЛИН 51)4 С 01 Ы 3304 ЕННЫЙ НОМИТЕТниям и отнРытиСР ГОСУДАРСПО ИЗОПРИ ГН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 47 но-исследовааны материнств и В.П.П омендации поного и витаминоров. М.имических к набору х определения м материалпредприят Производя Лахема с Май(71) Белорусский научтельский институт охи детства(56) Методические рисследованию минералного состава молока1978, с, 4-7,Инструкцияреактивов дляв биологическоство народного(57) Изобретение относится к способам исследования состава молока с помощью набора химических реактивов, включающих глиоксаль-бис-(2-оксианил) и направлено на повышение точности. По реакции содержащегося в пробе молока кальция с указанным реактивом в щелочной среде с образованием комплекса красного цвета фотометрическим измерением определяют к ячество кальция. При этом в происследуемого молока дополнительно вносят бутнловый или изобутиловый спирт в количестве, обеспечивающем исчезновение мути. Измерение значений оптической плотности проводят при длине волны 530-540 нм. 8 табл.1446564 18 Продолжение табл, 5 0,130 О, 095 570 0,191 0,183 0,165 545 580 550 590 0,065 560 Таблица 6 Концентрация кальция, Показатели ммольл ОНш), в достоверности пробах молока Бутиловый 1,75 30,00+0,261 1,10Р 70 1 Бутиловый 1,80 30,450,315 е -з = 0,73Р О,1е= 0,73 29,9 7+О, 26 5 Изобутиловый 1,75 30,37+0,431 Изобутиловый 1,80 ТаблицаПоказатели достоверности Концентрациякальция,ммоль/л(МФш), впробах молока Бутиловый 1,75 Бутиловый 1,80 5,62+0,035 5,6110,032 Изобутиловый 1,75 5,59 Т 0,025 Т г = 0,22= 0,22 5,6010,032 Продолжение табл, 5 Объем добавляемого спирта, мл Объем добавляемого спирта,мп Изобутиловый 1,80 с 1 г Оф 211446564 20 Таблица 8 Показатели достоверности Объем добавляемого спирта, мп Р 1 7 0,1 й=0,54 Сз=1 э 23 86,250,442 Иэобутиловый 1,75 й т =0,65 й, = 0,47 85,87 Ф 0,684 Изобутиловый 1,80,Составитель Н.АрцыбашеваТехред Л.Сердюкова Корректор Г.Решетник . Редактор Н.Тупица Заказ 6743/50 Тираж 847, ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР1 13035, Иосква, Ж, Раушская наб., д . 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Бутиловый 1, 75 Бутиловый 1, 80 Концентрациякальция,ммоль/л (Иш),в пробах молока 85,430,0442.85,24+0,688Изобретение относится к областибиологии и медицины, в частности кспособам исследования биологическихжидкостей, преимущественно составаженского молока.Цель изобретения - повышениеточности определения капьция в биологической жидкости, преимущественно вженском грудном молоке. 10Предлагаемый способ позволяетработать с минимальными количествами проб, что крайне важно при клинических исследованиях состава грудного женского молока, Кроме того,повышение точности при неизменномсостава и количественной сторонереактивов известного способа обусловлено адаптацией к этим количествам граничнцх значений количеств 20бутилового и изобутилового спирта,что обеспечивает исчезновение мутности, вызываемой присутствием сложныхлипопротеидных комплексов, и следовательно,. снижение значений оптической плотности,Способ осуществляют следующим образом.В чистую сухую пробирку вносят1,0 мп дистиллированной воды, 0,02 мл З 0разведенного в 10 раз молока и 0,5 млраствора гидроокиси натрия с концентрацией ее 0,4 моль/л. Раствор перемешивают и через 5-10 мин добавляют2,0 мл О, 1 -ного раствора глиоксаль-бис.-(2-оксианила) в метаноле, снова35перемешивают и через 5 мин добавляют 1,75-1,80 мп бутилового или изобутилового спирта, Добавление бутилового или изобутнлового спирта через5 мин обусловлено тем, что за это время заканчивается образование цветногокомплекса кальция с глиоксаль-бис-(2-оксианилом), что следует из инструкции к набору реактива и подтверждается данными табл.4. Параллельно,так же как и пробу исследуемой биологической жидкости, например молока,обрабатывают эталонный раствор кальция и раствор сравнения, в которыхсоответственно вместо 0,02 мл молокаберут 0,02 мл эталонного растворакальция с концентрацией его2,5 ммоль/л и 0,02 мл дистиллированной воды.Все пробы перемешивают и измеряютоптическую плотность исследуемой иэталонной проб против раствора сравнения, Измерения проводят в кювете(1 см) при длине волны 530-540 нм,не позднее 15 мин от момента добавления глиоксаль-бис-(2-оксианила).Содержание кальция в молоке, ммоль/л, рассчитывают по формуле Х = - 2,510,где Х - содержание кальция в исследуемом молоке, ммоль/л,А - оптическая плотность опытной пробы,Б - оптическая плотность эталонной пробьц2,5 - концентрация кальция в эталонной пробе, ммоль/л;10 - степень разведения исследуемого молока.Повышение точности определениякальция согласно предлагаемому способу по сравнению с известным подтверждается данными, представленными втабл.1 (5 параллельных определенийодной и той же пробы молока).Сравнительный анализ результатовстатистической обработки величиныоптической плотности цветногб продукта реакции при определении кальцияпо предлагаемому способу и известному показывает, что в первом случаевеличины средней ошибки средней арифметической (ш) и среднеквадратического отклонения ( 6 ) значительно ниже, чем при определении кальция поизвестному способу, что свидетельствует о большей точности предлагаемого способа.В табл,2 пред:тавлены результатыисследования, предпринятого с цельюустановления оптимального количествадобавляемого бутилового спирта.В табл.З представлены сравнительные результаты определения кальцияпо предлагаемому способу при добавлении бутнлового или изобутнлового спирта,В табл.4 представлены данные поустойчивости окраски цветного комплекса продукта реакции прн определениикальция по предлагаемому способу сдобавлением 1,75 мл бутнлового илиизобутилового спирта. Во всех исследованиях проводилось по 5 параллельных определений одной и той же пробымолока.В табл.5 представлены данные спектра поглощения нветного комплекса продукта реакции при определении кальцияз 1446 в молоке по предлагаемому способу с добавлением 1,75 мл бутилового спирта. Х= -2510АБ Из представленных данных следует, что добавление бутилового спирта в объеме 1,75-1,8 мл достаточно для достижения поставленной цели. Дальнейшее увеличение объема добавляемого бутилового спирта не влияет на повышение точности определения кольция, а только приводит к достоверному снижению оптической плотности в связи с разбавлением раствора.Из полученных результатов следует, что нет достоверной разницы в оптической плотности проб при добавлении 1,75-1,80 мл бутилового или изобутилового спирта.Из представленных данных следует, что окраска цветного комплекса продукта реакции устойчива в интервале 6-15 мин от момента добавления раствора глиоксаль-бис-(2-оксианила) . 25Из полученных результатов следует, что максимальное поглощение цветного комплекса наблюдается в диапазоне Л = 530-540 нм. П р и м е р 1. В. семь чистых сухих пробирок наливают по 1,0 мл дистиллированной воды, вносят в пробирки 9 1, 9 2, 9 3 по 0,02 мп одной и той же , пробы молока (разведенного в 10 раз дистиллированной водой), в пробирки 9 4, 9 5, 9 6 по 0,02 мл эталонного раствора кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л и в пробирку 9 7 0,02 мл дистиллированной воды (раствор сравнения), перемешивают и вносят во все пробы по 0,5 мл раствора гидроокиси натрия с концентрацией ее 0,4 моль/л. Все пробы перемешивают и через 5-10 мин добавляют по 2,0 мл 0,1 Е-ного раствора глиоксаль-бис-(2- -оксианила) в метаноле, снова перемешивают и через 5 мин добавляют во все пробы по 1,75 мл бутилового спирта. После этого все пробы опять тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность опытных и эталонных проб против раствора сравнения. Измерения проводят в 1 см кювете при длине волны 530-540 нм, не позднее 15 мин от момента добавления глиоксаль-бис-(2-оксианила).Содержание кальция в молоке рассчитывают по формуле где Х - содержание кальция в исследуемой пробе молока,ммоль/л;А - оптическая плотность исследуемой пробы;Б - оптическая плотность эталонной пробы;2,5 - концентрация кальция в эталонной пробе, ммоль/л;10 - степень разведения исследуемого молока.Получены следующие результаты измерения оптической плотности исследуемых и эталонных проб: А 9 1 (пробамолока) = 0,243, А 9 2 (проба молока) = 0,240; А 9 3 (проба молока)= 0,200По указанной формуле рассчитываютЗО концентрацию кальция в исследуемыхпробах молока.Х 9 1 (проба молока) = 30,37 ммаль/л;Х 9 2 (проба молока) = 30,00 ммоль/лХ Р 3 (проба молока) = 29,63 ммоль/л.35 Таким образом, для исследуемойпробы молока И = 30,0 ш =+0,261;6 = 0,370,40П р и м е р 2. В том же образцемолока (в трех параллельных пробах) аналогично примеру 1, толькос добавлением на конечном этапе1,8 мл бутилового спиртаопределяют количество кальция, при этом получают следующие результаты оптической плотности исследуемой и эталонной проб: А 9 1 (проба молока)= 0,242; Б 9 4 (эталонный растворкальция с концентрацией его2,5 смоль/л) = 0,192; Б 9 5 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) = 0,196;Б 9 6 (эталонный раствор кальция сконцентрацией его 2,5 ммоль/л)По формуле, как и в примере 1, рассчитывают концентрацию кальция в исследуемых пробах молока.Х1 (проба молока)= 30,03 ммоль/л,5 Х2 (проба молока) = 30,11 ммоль/л, Х3 (проба молока) = 30,92 ммоль/л.Таким образом, для исследуемой пробы молока М = 30,45, щ =+0,315;6 = 0,446. 10П р и м е р 3, В том же образце молока (в трех параллельных пробах) аналогично примеру 1, только с добавлением на конечном этапе 1,75 мл изобутилового спирта, определяют количество кальция, при этом получают следующие результаты оптической плотности исследуемой и эталонной проб: А1 (проба молока) = 0,244; А Р 2 (проба молока) = 0,238; А3 20 (проба молока) = 0,241, Б4 (эта - лонный раствор кальция с концентра, цией его 2,5 ммоль/л)=0,203; Б5 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) = 0,199; 25 Бб (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) = 0,201, средняя Б. 4-6 (эталонный раствор) = 0,201.По формуле аналогично примеру 1 рассчитывают концентрацию кальция в исследуемых пробах молока.Х1 (проба молока)= 30,35 ммоль/л; Х У 2 (проба молока) = 29,60 ммоль/л, Х3 (пробамолока) = 29,98 ммоль/л.35Таким образом, для исследуемой пробы молока М = 29,97; ш = 10,265;6 = 0,37540П р и м е р 4. В том же образце молока (в трех параллельных про. бах) аналогично примеру 1, только с ,добавлением на конечном этапе 1,80 мл изобутилового спирта, определяют ко 45 личество кальция, При этом получены следующие результаты оптической плотности опытной и эталонной проб: А1 (проба молока) = 0,234; А2 (проба молока) = 0,232; А3 (проба молока) = 0,241; Б4 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) = 0,197 Б5 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) = О, 194; Бб (эталонньж раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) = О, 192; средняя Б У 4-6 (эталонный раствор) = = 0,194. По формуле аналогично примеру Грассчитывают концентрацию кальция вопытных пробах молока.Х1 (проба молока) = 30,15 ммоль/л,Х2 (проба молока) = 29,90 ммоль/л",Х 3 (проба молока) =31,06 ммоль/л.Таким образом, для исследуемой пробы молока М = 30,37 щ = ф 0,431; б== 0,610.Полученные результаты определениякальция в одних и тех же пробах молока с использованием граничных значений объемов добавляемого бутиловогои изобутивлого спирта представленыв табл.б (сравнительный анализ сиспользованием статистической обралотки результатов исследований невыявил различий между ними),Таким образом, приведенные примеры доказывают полное совпадение ререзультатов исследования молока насодержание кальция по предлагаемомуспособу при использовании граничныхзначений объемов бутилового и изобутилового спирта.П р и м е р 5. Определение кальция в трех параллельных пробахженского молока проводят по примеру 1, только молоко предварительноне разводят дистиллированной водой.Добавляют 1,75 мл бутилового спирта.Содержание кальция в исследуемойпробе молока рассчитывают по формулеХ = - 2,5,А где Х - содержание кальция в исследуемой пробе молока,ммоль/л;А - оптическая плотность опытнойпробы;Б - оптическая плотность эталон.ной пробы;2,5- концентрация кальция в эталонном растворе, ммоль/л.Получены следующие результатыоптической плотности исследуемой (А)и эталонной (Б) проб: А1 (пробамолока) = 0,454; А2 (проба молока) = 0,450; А3 (проба молока)По формуле, как в примере 4, рассчитывают концентрацию кальция в1опытных пробах молока.Х Р 1 (проба молока) = 5,67 ммоль/л;Х У 2 (проба молока) = 5,62 ммоль/л;Х В 3 (проба молока) = 5,57 ммоль/л.Таким образом, для исследуемойпробы молока М = 5,62; тп = +0,035;6 = 0,050. 1 ОП р и м е р 6. По примеру 5, только с добавлением на конечном этапе 1,80 мл бутилового спирта,определяют количество кальция в тех же пробах молока. Концентрация кальцияв исследуемых пробах молока рассчитывают по формуле аналогично примеру 4.Получены следующие конечные результаты определения кальция в исследуемых пробах молока. Х Р 1 (пробамолока) = 5,61 ммоль/л; Х Р 2 (пробамолока) = 5,57 ммоль/л; Х 9 3 (пробамолока) = 5,66 ммоль/л.Таким образом, для исследуемойпробы молока М = 5,61, тп = +0,032; 256: 0,045,П р и м е р 7. По примеру 5, только с добавлением на конечном этапе1,5 мл изобутилового спирта, определяют количество кальция в тех жепробах молока. Концентрацию кальцияв исследуемых пробах молока рассчитывают по формуле аналогично примеру 5. Получены следующие конечныерезультаты определения кальция в исследуемых пробах молока. Х В 1 (проба молока) = 5,63 ммоль/л Х Ф 2(проба молока) = 5,56 ммоль/л;Х В 3 (проба молока) = 5,58 ммоль/л.Таким образом, для исследуемойпробы молока М = 5,59 тп = +0,025;Ь= 0,036.П р и м е р 8, По примеру 5, только с добавлением на конечном этапе1,8 мл изобутилового спирта, опреде 45ляют количество кальция в тех же пробах молока. Концентрацию кальция висследуемых пробах молока рассчитывают по формуле аналогично примеру 5.Получены следующие конечные результаты определения кальция в исследуемых пробах молока. Х В 1 (проба молока) = 5,56 ммоль/л Х В 2 (пробамолока) = 5,60 ммоль/л; Х Ф 3 (проба молока) = 5,65 ммоль/л,55Таким образом, для исследуемойпробы молока И .= 5,60; в = +0,032,6 = 0,045. Полученные результаты определения кальция в одних и тех же пробахмолока (при небольшом содержании егов молоке) с использованием граничныхзначений объемов бутилового и изобутилового спирта представлены втабл.7 (сравнительный анализ с использованием статистической обработки результатов исследования невыявил различий между ними).,Таким образом, приведенные данные показывают полное совпадениерезультатов определения кальция вмолоке (при небольшом его содержаниив нем) по предлагаемому способу прииспользовании граничных значений объемов бутилового и изобутилового спирта.П р и м е р 9. Определение кальцияв трех параллельных пробах молока проводят по примеру 1, причем молокоразводят в 10 раз дистиллированнойводой. Добавляют 1,75 мл бутиловогоспирта. Содержание кальция в исследуемой пробе рассчитывают по формуле, как в примере 1.Получены следующие результаты оптической плотности исследуемой и эталонной проб: А У 1 (проба молока)- 0,680, А У 2 (проба молока)= 0,685; Б В 4 (эталонный растворкальция с концентрацией его2,5 ммоль/л) = 0,202; Б У 5 (эталонный раствор кальция с концентрациейего 2,5 ммоль/л) = 0,198; Б 0 ф 6 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) = 0,197, средняя Б 9 4-6 (эталонный раствор)О, 199,Х У 1 (проба молока) = 85,43 ммоль/л;Х У 2 (проба молока) = 84,80 ммоль/лХ У 3 (проба молока) = 86,05 ммоль/л.Такимм образом, для исследуемойпробы молока М = 85,43;= +0,442;0,625.П р и м е р 10. Определение кальция проводят по примеру 1 в тех жеразведенных в 10 раз дистиллированной водой пробах молока, что и в примере 9, только с добавлением наконечном этапе 1,80 мл бутиловогоспирта. Содержание кальция в исследуемой пробе молока рассчитывают поформуле, как в примере 1. Полученыследующие конечные результаты определения кальция в исследуемых пробах.Х М 1 (проба молока) = 85,46 ммоль/л, 1446564Ро 4 Х Ф 2 (проба молока) = 86,09 ммоль/лХ У 3 (проба молока) =84,18 ммоль/л.Таким образом, для исследуемойпробы молока М = 85,24 м = 10,688,6 = 0,973.П р и м е р 11. Определение прово.дят по примеру 1, в тех же разведенных в 10 раз дистиллированной водойпробах молока, что и в примере 9, 10только с добавлением на конечномэтапе 1,75 мл изобутилового спирта.Содержание. кальция в исследуемойпробе рассчитывают по формуле, какв примере 1. 15Получены следующие конечные результаты определения кальция в исследуемых пробах: Х Ф 1 (проба молока)= 85,63 ммоль/л; Х В 2 (проба молока) = 86,25 ммоль/л; Х М 3 (проба 20молока) = 86,88 ммоль/л,Таким образом, для исследуемойпробы молока Г 1 = 86,25, ш = +0,442;6 = 0,625.П р и м е р 12. Определение проводят по примеру 1, в тех же разведенных в 10 раз дистиллированнойводой пробах молока, что и в примере 9, только с добавлением на конечном этапе 1,80 мл изобутилового спирта. Содержание кальция в исследуемой пробе молока рассчитывают по формуле, как в примере 1.Получены следующие конечные резуль.таты определения кальция в исследуемых пробах. Х 9 1 (проба молока)35= 85,66 ммоль/л Х В 2 (проба молока) = 85,03 ммоль/л, Х У 3 (проба молока) = 86,93 ммоль/л.Таким образом, для исследуемой пбы молока М = 85,87, ш = +0,684;Ь = 0,968.Полученные результаты определениякальция в одних и тех же пробах молока (при большом его содержании в нем) 45с использованием граничных значенийобъемов бутилового и изобутиловогоспирта представлены в табл.8 (сравнительный анализ с использованием статистической обработки результатов исследования не выявил различий междуними).Таким образом, приведенные данныедоказывают полное совпадение результатов определения кальция в молоке (прибольшом его количестве в нем) по пред 55лагаемому способу при использованииграничных значений объемов бутиловогои изобутилового спирта.Формула изобретения Т а б л и ц а 1 лага 0,245 Проба прозрачная То ж 0,23 40 О, 236 М=0,24= + 0,0017 0034 естный 0,720 роба очен мутна о ж Способ определения кальция в биологической жидкости, преимущественно в женском молоке, предусматривающий обработку проб исследуемой биологической жидкости, эталонного раствора кальция и раствора сравнения путем последовательного введения в данные пробы щелочи и раствора реактива глиоксаль-бис-(2-оксианил), измерение значений оптической плотности образовавшегося комплекса красного цвета проб и определение кальция по соотношению измеренных значений оптических плотностей, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности, определение значений оптической плотности проводят при длине волны 530-540 нм, а перед измерением значений оптической плотности в пробы вносят бутиловый или изобутиловый спирт в копичестве, обеспечивающем исчезновение мутности проб.=0 038 Таблица 2 Мутность илипрозрачностьпробы Добавляемыйобьем бутилового спирта,мп М 0,360 1,0 Проба мутная ш = +0,0127 То же 6 = 0,0254 Проба слабо мутнаяТо же М = 0,300ш =й 0,00796 = 0,0158 Проба прозрачнаяТо же М 1= +Оэ 240 ш =0,0016 6= 0,00316 1,75 Проба прозрачная м = 0,236ш = +оу 00216 = 0,0042 1,8 То же Оптическая плотность, Е 0,390 0,360 0,330 0,340 0,380 0,310 0,290 0,320 0,280 0,300 0,244 0,2360,240 0,242 0,238 0,238 0,2320,235 0,242 0,232 П р и м е ч а н и е. Большаяоптическая плотность проб при определении кальция в молоке по извест ному способу обусловлена значительной мутностью проб.Примечание; Таблица 3 Оптическан плотность пробы (К) при добавлении спирта1446564 15 Таблица 4 Измерение на спектрофотометре, кювета с толщиной рабочего слоя 10 мм,3= 535 нм. Концентрация исследуемого раствора кальция, 2,5 ммоль/л, Оптическая плотность, Е (М + т) Время от момента добавления раст вора глиоксальбис-(2-оксианила)мин Достоверность, Изобутиловый, Достоверность,Р спирт Р(0,00 П р и м е ч а н и е: М Ф ш рассчитывают из пяти параллельных проб.Достоверность измерений оптической плотности рассчитывают по отношению к оптической плотности на4-й минуте. Продожение табл, 5 О, 183 52 53 0,20 О,0,200 0,200 440 538,20 55 0,13 0,20 0,1 Т а б л и ц а 5 Измерение на спектрофотометре, кювета с толщиной рабочего слоя 10 мм. Концентрация исследуемого раствора каль Оция 2,5 ммоль/л,О, 198+0,0019 0,200+0,0021 0,200+0,0022 0,200+0,0020 0,199 ф 0,0021 0,198+0,0020 О, 191+0, 0018 О, 182+0, 0020 О, 128+0, 0022