Способ определения гидрофобных соединений в биологических жидкостях

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 119) 01) 1 М 33/48, 33/50 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ У СВИДЕТЕПЬСТ ТОР льский инстипытаниям хи оров ов орукв В.В.,ология,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР по делАм изоБРетений и ОтнРьт(71) Научно-исследоваттут по биологическим имических соединений.(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРОфОБНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХЖИДКОСТЯХ путем добавления пробы в среду, содержащую бактериальную люциферазу, флавинмононуклеотид, альдегид и фосфатный буфер с последующей регистрацией снижения люминесценции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности, н качестве альдегида используют октаналь в концентрации 1 О -5 1 О М, в среду инкубации дополнительно вводят восстановленный никотинамидадениндинуклеотидф -Фв концентрации 10 -5 1 О М, а люциферазу и Ьлавинмононуклеотид используют в концентрациях 0,02- 0,4 мг/мл и 10 -5 " 10 М соответственно.Изобретение относится к биохимиии медицине и может быть использовано для определения гидрофобных соединений в биологических жидкостях,например, при осуществлении контроля за трансформацией и накоплениемв организме человека лекарственныхсредств по накоплению их в биологических жидкостях,Цель изобретения - повышениечувствительности определения,П р и м е р 1; Сначала получают бактериальную люциферазу следующим образом.Культуру РЬоСоЬасег 1 пш йзслегь.11 6 МГУ, растущую на твердой средеследующего сосТава, вес.7.: морскаявода 38, пептон 1; мясо -пептонныйбульон 8; агар-агар 2, дистиллированная вода остальное, высеиваютв жидкую среду состава,вес.7:ЙаНРО, 0171 КНРОф 0,1 ф(14 Й,НРО 0,05; Му 50,1 0,01 р пелтон 1; М аС 1 28; дистиллированнаявода остальное, рН 7,4; через 11 ч200 мл культуры стерильно переносят в ферментер емкостью 10 л стой же самой средой и осуществляют.Ферментацию 9 ч при контроле и поддержании постоянным рН среды (7,0 )и уровня растворенного кислорода(107 от насыщения) при 22 С, Поокончании ферментации клетки отделяют от культуральной жидкостицентрифугированием при 25000хх 30 мин и разрушают лизисом в калий-натрий - фосфатном буфере0,02 М, рН 7,0 с дитиотрейтолом спомощью Тритон Хв качестве детергента в количестве 0,57 от весаклеток в течение 40 мин при 17 С сопоследующей обработкой ультразвуком 22 кГц х 2 мин. (Э = 0,6 А, прибор УДЗ), Буфер добавляют в соотношении 4:1 (объем/вес клеток).Крупные частицы удаляют центрифугированием при 105 000х 1 ч. Затем.проводят дробное осаждение белков сульфатом аммония в диапазоне40-757. от насыщения, Осадок растворяют в 50 мл /1 а - фосфатногобуфера (состав тот же), наносят наколонку с сефадексом-10 для быстрого диализа, затем активную фракцию наносят на колонку с сефадексом-100 для очистки от балластанизко- и высокомолекулярных соеди"нений. Полученный препарат люцифе тивной системы, содержащей в0,02 М калий-натрий-фосфатный буфер, 1 О М октаналь, 10 М НАДН,0,02 мг/мл люциферазы и 1 О М ФМН50 оконечный объем пробы 1 мл,Оценку ингибиторного эффекта проводят как в примере 1.Результаты анализа действия лекарства приведены в табл.2,.55Как видно из табл,2, введениеэтазола приводит к увеличению ингибирования Ферментативной люминесцентной системы образцами смешанной 5 10 15 20 25 30 35 40 разы переводят в летучий буфертриэтиламин - НС 1 0,01 М, рН 8,8 азатем лиофилизируют, Окончательный продукт люцифераза имеет степень очистки в 120 раз по активности с никотинамидадениндинуклеотидом и удельную активность 2,0 10квант/с мг белка. Он стабилен прихранении при 0-4 С в течение двухлет.У пациента производят отбор смешанной слюны и определяют влияниеслюны на ферментативную активность,Измеряют на Фотометре интенсивностьсвечения пробы объемом 1 мл (величина 3, , контроль) которую получают добавлением 0,3 мл воды х 0,7 мл0,02 М калий-натрий-фосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 5 10 Моктаналь, 2 ф 10 М восстановленныйфникотннамидадениндинулкеотид(ФМН) и 0,1 мг/мл люциферазы, В опытной пробе вместо воды добавляют0,3 мл смешанной слюны, величина 3 , опыт . Пациенту вводят аминопирин в дозе 0,15 мг/кг веса и через 2,4, 20 и 24 ч измеряют интенсивность свечения, Величину ингибитарного эффекта оценивают поо-формулех 1007,оДанные приведены в табл,1,Как видно из табл.1, после приема аминопирина в слюне наблюдаетсянакопление лекарства и увеличивается ингибирующий эффект, За степеньюутилизации лекарства можно следитьпо уменьшению величины ингибирования свечения.П р и м е р 2. У пациента производят отбор смешанной слюны до ипосле введения 0,5 г/кг веса этазола и измеряют влияние 0,03 мл смешанной слюны на свечение ферментаТ а б л и ц а 1 11 оказатели 420 гибирова 47 2 Т абл оказ ател мя,109 1 48 3 1, шЧ7, ингибирования б а азател 7 2 326 7 ингибировани 8 Тираж 7 8 Подпи си о 4/5 БИВАК За ест", г.Ужгород Проектная,Филиал ППП 3 120851 слюны. Из этих данных видна эффективная трансформация лекарственного соединения в организме человека.П р и м е р 3. У пациента производят отбор смешанной слюны до ипосле введения 0,5 г этазола и измеряют влияние 0,2 мп смешанной слю 1 4ны на свечение ферментативной системы (конечный объем 1 мп), содержащей 5 10 М октаналь, 5 0 М НАДН, 0,4 мг/мл люциферазы и 5 " О М ФМН.Оценку ингибиторного эффекта проводят как в примере 1.Результаты анализа действия этазола приведены в табл.3. после введения этазола