Способ выделения винкристина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 7 91 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АТЕН У 3Компани (0 Б)жокс(ПБ)(54) (ТИНА ащеготадии кисл кстрак кстрак ции цел рас ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ .ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Зли Лилли энд(56) Патент Венгриикл. ЗОН 1-8, опублик СПОСОБ ВЬДЕЛЕНИЯ ВИНКРИС- природного источника, содер инкалкалоиды, включающий кстрации целевого продукта ния экстракта кислотой, наерной, промывки кислого а бензолом, подщелачивания а водным аммиаком, экстраквого продукта из полученноора бензолом, упаривания бензольного экстракта, растворение остатка в этаноле, переведения целевого продукта в сульфат, кристаллизации из этанола, переведения в свободное. основание с помощью водного ам миака, колоночной хроматографии на окиси алюминия с последующим выделением целевого продукта или в свободном виде или в виде соли, например сульфата, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве источника винкалкалоидов используют СаСЬагап спайз гозецз, экстракцию проводят водой подкисленной серной кислотой, перед кристаллизацией целевого продукта в виде сульфата проводят его гель- фильтрацию хроматографией на сефадексе в кислой среде с последующей нейтрализацией фракции, содержащей целевой продукт, и экстракцией продукта бензолом, упариванием экстракта и выделением целевого продукта с помощью хроматографии высокого давления при 17-22,8 ати.Изобретение относится к усовершенствованному способу выделения винкристина, применяющегося в медицине при лечении лимфогранулематоза.Пель изобретения - возможность 5 обеспечения получения целевого продукта с более высоким выходом.П р и м е р 1. Выделение винкристина.10 кг сухого остатка СаС 11 агап 10 СЬыз гозепз экстрагируют три раза, каждый раз в течение 1 ч, 32 объемао,ми воды при 50 С, подкисленной до значения рН 3,0 добавлением 30%-ной (вес.7, на объем) серной кислотой в 15 качестве экстрагирующей среды. Водные экстракты декантируют с волокнистого материала, объединяют и фильтруют. Фильтрат экстрагируют дважды равными объемами бензола и 2 бензольные экстракты отбрасывают. Значение рН фильтрата повышают до 6,0 добавлением концентрированной . гидроокиси аммония. Водную фазу при значении рН 6,0 экстрагируют три 2 раза равными объемами бензола. Бензольные экстракты объединяют, концентрируют в вакууме и получают в качестве остатка 57 г сырой алкалоидной смеси. 5 г смеси, полученной таким образом, растворяют в 250 мл 1,0 М цитрата аммония в качестве буфера при значении рН 3,0 и результирующий фильтрат хроматографируют на 600 г декстранового геля (сефадекс СГ) в 5140 см стеклянной колонке, 0,1 М буфер цитрата аммония (рН 3,0) применяют в качестве подвижной фазы. Колонку элюируют под давлением в головной части 1,05 кг/см при скорости потока вытекающей жидкости в пределах 10-14 мл/мин, Фракции собирают и идентифицируют как содержащие преимущественно мономерные или димерные алкалоиды с помощью тонкослойной хроматографии. Фракции, которые содержат димерные алкалоиды, элюируют первыми, они содержат под данным тонкослойной хроматографии винбластин, винкристин, лейрозин и винрозидин. Водные фракции, содержащие преимущественно данные димерные алкалоиды, объединяют, значение рН довоцят до 7,0 с помощью гидроокиси аммония и результирующий водный нейтральный раствор экстрагируют три раза по 0,5 от его объема бензолом,О 5 О Х 4 О 50 а 5 Бензольные экстракты собирают и фильтруют через безводный сульфат натрия. Концентрирование фильтрата до сухого остатка в вакууме дает 1,0 г смеси димерных алкалоидов. Смесь растворяют в 7,5 объемах безводного этанола. При этом происходит кристаллизация .пейрозина, которьщ отделяют центрифугированием, Выход составляет 157 мг лейрозина. Верхний слой доводят до значения рН 4,2 37-ной этано:."ьной серной кислотой. Сульфаты остальных димерных алкалоицов выделяются сразу же в виде игольчатых кристаллов и кристаллизацию продолжают в течение двух дней, Кристаллы отделяют центрифугированием, промывают этанолом и сушат.Выход составляет 241 мг смеси сульфатных солей винбластина и винкрис.тина с примесью небольшого количества сульфата лейрозина. Соли превращают в соответствуюшие свободные основания растворением в воде, доведением значения рН водного раствора до 8,0 с помощью 14 н. гидроокиси аммония и последующим экстрагированием воцонерастворимых оснований метиленхлоридом. Метиленхлоридный экстракт фильтруют и растворитель удаляют выпариванием в вакууме, Образующийся остаток хроматографируют на 400 г окиси алюминия (активность Ш. 200 м/г), с использованием в качестве элюента системы растворителей метилацетат;метиленхлорид;вода (48:51:1). Хроматографирование проводят в колонке иэ нержавеющей стали (8 мм на 7 м) при давлении 17,6 - 22,8 кг/см, Соотношение количества окиси алюминия и смеси алкалоидов составляет приблизительно 2000/1, Выход элюата контролируют по поглощению при 254 мм, и фракции отделяют в соответствии с максимумами в УФ- спектр: поглощения. Идентифицируют фракции, содержащие преимущественно лейрозин, винбластин, дез-метилвинбластин и винкристин, Концентрирование объединенных фракций, содержащих винкристин, до сухого остатка дает 18,7 мг алкалоида. Остаток растворяют в 20 объемах безводного этанола, нерастворимую часть отделяют центрифугированием и доводят значение рН верхнего слоя до 4,2 с помощью 37-ной этанольной серной кислоты, при этом происхоцит кристаллизация винкристинсульфата, Кристал1207396 Составитель Ю.ХроповТехред А.Бабинец,Корректор Л.Патай Редактор Е.Папп Подписное Тираж 379ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Заказ 8745/61 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 лизацию смеси проводят путем вьдерживания ее при комнатной температуре в течение двух. дней. Затем отделяют винкристинсульфат центрифугированием, центрифугат промывают этанолом и сушат в вакууме. Вес полученйого при этом винкристина составляет 12,3 мг (эквивалентно 14,1 мг/кг экстрагированного остатка). Свойства винкристинсульфата, полученного предлагаемым способом, идентичны приведенным в литературе.П р и м е р 2, 10 г смеси алкалоидов, полученной в условиях примера 1 на стадии, предшествующей хроматографии высокого давления, растворяют в 5 объемах безводного эталона. Значение рН раствора доводят до 4,2 добавлением ЗХ-ной серной кислоты (этанольный раствор).Смесь сульфатов затравливают винбластинсульфатом. Кристаллизацию смеси проводят выдерживанием ее в течение 48 ч и смесь сульфатов диметральных алкалоидов выделяют центрифугированием. Описанная процедура, сопровождающаяся затем стадией ,гельпроникающей хроматографии с хром матографированием на дезактивированной окиси алюминия под высоким давлением, приводит к получению 20,6 мг винкриг.тинсульфата, что эквивалентно 11,8 мг/кг экстрагированного остатка.П р и и е р 3. Перевод дез-И- метилвинбластина в винкристин.270 кг сухих остатков Сайагап й 1 шз гозеиз обрабатывают в условиях примера 1. Фракции, идентифицированные с помощью тонкослойной хроматографии, как содержащее дез-И-метилвинбластин, выделяют с помощью жидкостной хроматографии под высоким давлением и концентрируют в вакуумедо сухого остатка. Полученные 7,73 гсырого дез-И-метилвинбластина переводят в винкристин при комнатнойтемпературе добавлением раствора,содержащего 927 мл 987-ной муравьиной кислоты и 154 мл уксусного ангидрида. После завершения реакции,(что устанавливают с помощью тонко О слойной хроматографии) реакционнуюсмесь концентрируют в вакууме до сиропа. Концентрат растворяют в 100объемах воды, а алкалоиды превращаютв соответствующие свободные основанияэкстрагированием водного растворапри значении рН 5,8 метиленхлоридом(троекратным). Концентрированиеобъединенных метиленхлоридных экстрактов под вакуумом приводит к образованию 7,84 г свободного основаниявинкристина. Свободное основаниедалее очищают с помощью жидкостнойхроматографии под высоким давлением(14,1-21,1 кг/см), в колонке 2,5 смкх 730 см из нержавеющей стали с ис.пользованием 3200 г нейтральной окиси алюминия (активность И-У) в каче"тве адсорбента и смеси этилацетат:метиленхлорид:вода (25:75:0,4) вкачестве подвижной фазы, Выход винкристина, полученного после концентрирования до сухого остатка соответствующих фракций, составляет 2,64 г.Это вещество дважды перекристаллизовывают из этанола повторно хромаЭтографируют с использованием смесиметилацетат:метиленхлорид:вода