Способ трансформации дрожжей

,8011974в 4 С 12 И 15/00 НОЙ КОМИТЕТ СССРБРЕТЕКИЙ И ОТКРЫТИЙ ССУД АРСТВО ДЕЛАМ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСК СВИДЕТЕЛЬСТВ РОЖ(54)(57) СПОС ЖЕИ путем обр агентами, о то,ло- ба клетки д сихиноли ва,8-о 250 пла мкг/мл с п мидной ДНК.С.Кирилхачева и Б ТРАНСФОРИАЦИИ Д ботки хелатирующими л и ч а ю щ и й с я лью упрощения спосожжей обрабатывают м в концентрации 50- оследующей обработко197463 2 1Изобретение относится к областимолекулярной генетики, в частностик получению компетентных к трансформации клеток дрожжей, которые могут быть использованы для введения,клонирования и изучения экспрессиичужеродного генетического материала.Целью изобретения является упрощение способа.Сущность предлагаемого способазаключается в том, что клетки дрожжей перед трансформацией инкубируют при 30 С в течение 60 мин в 1 О мМтрис буфере (рН 7,5) или минимальнойпитательной среде, содержащих 27 галактозы и 8-оксихинолин (конечнаяконцентрация 50-250 мкг/мл), затемклетки переносят в свежий трис буфер(10 мМ, рН 7,5), содержащий 1 мМнатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА и плазмиднуюДНК смесь инкубируют с осторожнымперемешиванием в течение 30 мин, после чего добавляют ПЭГ (мол.мас.4000)до конечной концентрации 35-407. и продолжают инкубацию еще н течение60 мин, с последующим прогревом смеси при 42 С в течение 5 мин. В реозультате такой обработки клеткидрожжей трансформируются плазмиднойДНК с высокой эффективностью (часто 4 -гта трансформации 10 -О в расчетена жизнеспособные клетки), о чем судили по .росту колоний трансформантов на селективной среде, состав которой соответствовал маркерным признакам используемых плаэмид,Предполагается, что обработка клеток липофильными комплексонами ионовжелеза приводит к изменениям концентрации свободного и связанного железа в липидном слое мембран и, следовательно, к изменению скоростиокислительных реакций липидов, с чемв настоящее время связывают структурно-функциональные перестройкимембран. Поскольку проникновениеДНК в клетку является мембраноэависимым процессом, то вышеперечисленные изменения в мембранах сказываются на уровне компетентности клетокк трансформации рекомбинантными ДНК.П р и м е р 1, Клетки дрожжейвыращивают на 0,677-ной дрожжевойазотнойоснове беэ аминокислот (ТИВ,Дифко, США) с добавлением 0,17. пептана и 27. глюкозы до плотности110 клеток/мл (логарифмическая фа 7за роста 1 с аэрацией при температуре 30 фС.После отмывки стерильной дистиллированной водой клетки суспендируют в 2 мл буфера, содержащего1 О мМ трис НС 1, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5(ТЭ-буфер) или н 2 мл 0,677 средыУБВ, содержащей 0,17. пептона и 27галактозы, а затем добанляют 8-оксихинолин до конечной концентрации50-250 мкг/мл. Инкубацию взвесиклеток продолжают 1 ч при 30 С с перемешинанием. Клетки осаждают и суспендируют в О, мл ТЭ-буфера беэ отмывки от оксихинолина и добавляют8-10 мкг плазмиды КВЕЕП 2. Реакционную смесь инкубируют 30 минопри 30 С с перемешиванием. Далее приливают 1 мл 35-407. ПЭГ (мол.мас.4000)и продолжают инкубацию в тех же условиях 1 ч. Затем пробы переносятна 5 мин в водяную баню 42 С, послечего клетки промывают дважды стерильной дистиллированной водой, суспендируют в 1 мл стерильной воды ивысевают :о 0,2 мл в селективнуюпо лейцину агариэонанную среду, содержащую 27 агара, 27 глюкозы, 0,677УИВ и аминокислоты метионин, триптофан, гистидин н конечной концентрации 1 О мкг/мл), Визуально видимыеколонии трансформантов появляютсяна 2-3 сутки. Частота трансформацииплаэмидой, несущей лейциноный дрожсУженой ген, достигала 1-8 10 иа жизнеспособную клетку.П р и м е р 2. Клетки выращиваютпри 30 С на 0,677.-ной дрожжевой азотной основе УНВ, содержащей 0,1% пептона и 2% глюкозы до плотности 1 фтАЙ 0 клеток/мл (логарифмическая Фаза роста). Осадок клеток из 2 млкультуры после отмывки стериальнойдистиллированной водой суспендируютв 2 мл 0,67%-ной УМВ, содержащей0,1% пептона, 27. галактозы и 8-оксихинолин н концентрации 50-250 мкг/мл.45. Инкубацию взвеси клеток продолжают1 ч при 30 С с перемешинанием. Клето,ки осаждают , суспендируют в 0,1 млТЭ буфера и добавляют плаэмиднуюДНК двух типов КВЕЕ 02, РУР 92 50Н 13 (по 5 мкг каждой) . Реакционную смесь инкубируют 30 мин прио30 С с перемешиванием. Далее приливаютмл 35-407 ПЭГ (мол.мас. 4000)и продолжают ипкубацию н тех же услонияхч . Затем пробы переносятна 5 мин в водяную баню 42 С, послечего клетки промывают .дважды дистиллированной водой, суспендируют вТираж 490 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий11 0 с ва Ж- аб Заказ 3319/2 3 35, Мо к , 35, Раушская нд. 4/5Производственно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4. 3 1197463 41 мл дистиллированной воды и высе- концентрации 10 мкг/мл. Визуально вают по 0,2 мл в селективную по лей- видимые колонии появляются на 2 сут цину и гистидину агаризованную сре" ки, частота трансформации одновреду, содержащую 2 Ж агара, 2 Х глюкозы, менно двумя плазмидами составляет 0,67 УИВ, метионин и триптофан в2-4 10 на жизнеспособную клетку.