Способ изготовления ферментного электрода

(51)4 01 Й 33/48 ГОСУдйфСТНЕНКЬ 9 КОМИТЕТ СССРпь дал и всеааФЯ н тепаОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ П:(ари БИБЛ"Л;КА4 К АВТОРСКОМУ.С 8 ИДЕТЕЛЬСТВУ Э(56) С 2 агк 2.С.1., Луопз С. ЕХесСго 1 е зузСешз гог сопйишепз аоп 1 йогхпдЫ сагй 1 очазсп 2 аг зцгдегу. Апп. 0.1.Асайзс 1862, 192, р.р. 29-45,ЮЖззоп Н ИсеИипд А;С.,МозЬасЬ К. Веегшхпайоп ой 82 осозе,игеа апй репьсИИп пзп 8 епзуаерН-е 1 есйгооез. " Восп 1 ш. ВорЬуз,Асйа, 1973, 320, р.р. 529-534. 801176250 А.(54)(57) СПОСОБ .ИЗГОТОВШ:НИЯ ФЕРМЕНТ НОГО ЭЛЕКТРОДА, включающий иммобили. зацию фермента на поверхностном слоестеклянного рН-электрода, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью снижения времени стационарного ответа и повышения чувствительности ферментативного исследования, на поверхность стеклянного электрода наносят слой латекса натурального каучука ИРи водный раствор фермента в концентрации 20-80 мг/мл .в соотношении от 1;2,5 до 1:1 сушат на воздухе 20"60 мин, полученный слой фиксируют 0,2."0,37-ным водным .раствором глутарового.альдегида при 1-6 С , в течение 8-12 мин.С:ный буфер, содержащий 10 М ЭДТАи 0,97 хлорида натрия, рН 7,2),В качестве измерительного прибора используют рН-метр рН-М 62, снабженный самописцем "РЕА 260" ("КайошеСег", Дания), или рН(СССР),а в качестве рН-электрода используютстеклянные рН-электроды С 2040 С(СССР),Характеристики полученного -.акимспособом ферментного рН-электрода:время достижения 997.-ного уровня отвеличины стационарного ответа( Грэз) составляет 60-80 с, максимальная чувствительность в единицах рН на декаду (5) составляет0,4, величина максимального изменения рН при насыщающих концентрацияхмочевины ( д рН о ) равна О, 7 единицрН, Снижение чувствительности электрода после двух месяцев непрерывной работы при комнатной температу-ре составило 10 . от исходной.П р и м е р 2. Ферментный рНэлектрод получают способом, аналогичным примеру 1, с тем отличием,что растворяют 8 мг уреазы в 0,1 млбуфера, сушку проводят в течение60 мин и электродное покрытие обрабатывают 0,37 раствором глутаровогоальдегида в течение 12 мин.Характеристики ферментного электрода: кр рр= 60-80 с, 5 = 1, 1 ед. рН,рН О = 1,9 ед. рН, снижение чувствительности электрода после двухмесяцев непрерывной работы при комнатной температуре составило 87 отисходной.П р и м е р 3. Ферментный рНэлектрод получают способом, аналогичным примеру 1, с тем отличием,что к раствору уреазы добавляют0,04 мл латекса (соотношение 2,5:1)сушку проводят в течение 60 мин.Характеристики ферментного электрода: Тзр= 30-40 с, 5= 0,7 ед. рН,дрН со = 1,1 ед, рН. Снижение чувствительности электрода после двухмесяцев непрерывной работы при комнатной температуре составило 117. отисходной.П р и м е р 4. Для изготовленияглюкозооксидазного рН-электрода навеску глюкозооксидазы (10 мг) (препарат фирмы "ВоеЬч 1 п 8 ег", ФРГ, судельной активностью 100 Е/мг), содержащую 1000 Е, растворяют в 11176250Изобретение относится к измерительной технике, в частности к способам изготовления ферментных рНэлектродов для определения концентрации субстратов ферментативных реакций, сопровождающихся связываниемили освобождением ионов водорода, иможет найти применение в здравоохранении и медицине при проведении клинических анализов, при контроле проницаемости ультрафильтрационныхустройств, например, во время, сеансагемодиализа.Целью изобретения является снижение времени стационарного ответаиповышение чувствительности ферментативного исследования.Способ осуществляют следующим образом.На чувствительную поверхность Остеклянного рН-электрода при комнатной температуре наносят слой эмульсии, содержащей водный раствор фермента в концентрации 20-80 мг/мл и .латекс натурального каучука ИР25(в соотношении от 1:1 до 1:2,5 исушат на воздухе в течение 20-60 мин,затем поверхность электрода обрабатывают водным раствором глутарового альдегида в концентрации 300,2-0,3 Е в течение 8-12 мин прио1-6 С, После удаления следов глутарового альдегида ферментный рН-электрод готов к использованию.П р и м е р 1. Для изготовленияуреазного рН-электрода навеску уреазы 2 мг (препарат фирмы "Мегс 1 с",с удельной активностью 200 Е/мг),соответствующую 400 Е, растворяют в0,1 мл 0,2 М трис НСВ буфера, содержащего 10 М ЭДТА, рН 7,4 при 6 Св течение 12 ч, а затем добавляют0,1 мл латекса натурального каучукаИР(соотношение 1:1). Полученную эмульсию тонким слоем наносят 45на чувствительную поверхность стеклянного рН-электрода и сушат на воздухе в течение 20 мин при комнатнойтемпературе. Затем электродное покрытие обрабатывают 0,27-ным водным 50раствором глутарового альдегида(препарат фирмы МегсЕ") в течениео8 мин при 6 С. Электрод отмывают50 мл дистиллированной воды в течение 10 мин, а затем 50 мл буферного 55раствора (в течение 15 мин) который-используют при аналитическомЗаказ 5353/44 Тираж 897 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж-З, Раушская наб д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 0,2 мл 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 10-МЭДТА, рН 7,0 при о4 С в течение 12 ч, затем добавляют 0,15 мл латекса ИР(соотношение 1,3: 1). Далее ферментный рН-элект род получают способом, аналогичным примеру 1, с тем отличием, что сушку на воздухе проводят в течение 40 мин, обработку глутаровым альдегидом проводят при 1 С.10Характеристики полученного таким способом глюкозооксидазного рН-электрода: С 099= 60-80 с, 5 = -0,9 ед. РН/йрН оо = -1,6 ед. рН. Снижение чувствительности электрода после 1 меся ца непрерывной работы при комнатнойтемпературе составило 307 от исходной. Изобретение позволяет упростить технологию изготовления ферментного рН-электрода за счет уменьшения количества операций и количества исходных ингредиентов, а также за счет снижения температуры изготовления ферментного рН-электрода до комнатной, снизить время развития стационарного ответа и повысить чувствительность ферментативного исследования.