Способ получения инсулина

/26; А 61 К 35/14 3 Ш А ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬ(71) Черновицкий ордена Трудового Красного Знамени государственный университет(56) 1. Ре апра Р, )пап 1 п-В 1 осйепцсаРгерачав 1 оп Яеъ-Уог 1 с-).опдоп, 1958, ч. 6,р. 28 - 35,2. Патент США4139611,кл. А 61 К 37/26, 1979,(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА, включающий в себя инкубацию компонентов крови и последующее выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности инсулина, инкубации подвергают отмытые эритроциты крови человека, которые выдерживают в течение 90 в 1 мин в растворе, содержащем физиологический раствор и этанол при соотношении эритроциты-физиологический раствор и этанол 1:1:0,007 - 0,014, затем эритроциты отделяют от супернатанта и выделение инсулина проводят путем гель-фильтрации супернатанта на сефадексе или осаждением с последующей кристаллизацией.Изобретение относится к биологии и медицине, и может быть использовано в практических целях для разработки способа промышленного получения наиболее эффективного для медицинских целей лечебного препарата инсулина человека; в научных целях для изучения . механизмов интернализации, депонирования и транспорта инсулина эритроцитами; для диагностического выявления резервов гормона в . форменных элементах крови лиц, подозреваемых в возможном развитии диабета и других эндокринных расстройств; для изготовления человеческого стандарт-инсулина и стандартных инсулинов различных животных.Известен способ получения как гормонаинсулина, так и медицинского препарата из поджелудочной железы путем экстракции его подключенным 70 спиртом с последующей многоэтапной очисткой экстракта от примесей белков и липидовОднако известный способ не пригоден дляполучения инсулина человека.,Известен также способ получения инсулина из крови или компонентов крови теплокровных животных, при этом кровь или форменные элементы предварительно разбавляют 0,5 - 0,4 объемами гидрофильного разбавителя, доводят рН полученного раствора от 2 - 4 до 8 - 10 и инкубируют обработанную таким образом кровь при 15 - 40 С по крайней мере несколько часов.Далее кровь охлаждают до 10 С, диализуют после нейтрализации через мембрану, проницаемую для молекул с мол. мас. 6000 и из диализата выделяют органические пептидсодержащие вещества, имеющие мол. мас 350 - 6000 и инсулиноподобную активность 14 - 40 мкед/мг твердого вещества.Практическое применение способа позволило получить в среднем из 100 л крови животных до 320 г целевого продукта, активность которого равна 14 - 40 мкед/мг при определении ее по биологическому действию на выделенных адипоцитах 12.Таким образом, техника извлечения по этому способу инсулина дает малый выход, сложна, трудоемка и продолжительна, требует при операциях изменения рН и температуры, После инкубации из смеси извлекается далеко не весь гармон, а только тысячная его часть. Форменные элементы и плазма крови после получения инсулина не могут быть использованы в гематологии и для научных целей. Цель изобретения - повышение активности и выхода инсулина.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения инсулина, включающему в себя инкубацию компонентов крови и последующее выделение целевого продукта, инкубации подвергают отмытые эритроциты крови человека, которые выдер 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 живают в течение 90 в 1 мин в растворе, содержащем физиологический раствор и этанол при соотношении эритроциты в физиологический раствор и этанол 1:1:0,007 - 0,014, затем эритроциты отделяют от супернатанта и выделение инсулина проводят путем гель-фильтрации супернатанта на сефадексе или осаждением с последующей кристаллизацией,Способ осуществляют следующим образом.Отделяют эритроциты от плазмы крови путем отстоя или центрифугирования. К эритроцитарной массе добавляют изотонический раствор хлористого натрия (9 г. на литр) в соотношении 1:10. Смесь перемешивают и центрифугируют при 2000 об в минуту .(д = 800) в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают, Эритроцитарную массу промывают, таким образом, три раза, После отмывания к эритроцитам добавляют изотонический раствор ХаС 1, содержащий этанол так, чтобы соотношение объемов зритроциты, физиологический раствор, этанол, составляло 1;1:0,007 - 0,014. Инкубацию полученной смеси проводят при 20 С и полиэтиленовой емкости. Время инкубации 90 - 120 мин. Затем путем центрифугирования (д == 800; 10 мин) отделяют супернатант. Эритроциты и отделенная вначале процесса плазма крови годны для дальнейшего использования в гематологии, Полученный супернатант подвергают биохимическому фракционированию для выделения инсулина. Инсулин получают путем гель-фильтрации на колонке с сефадексом Г;, высотой 80 см и диаметром 1,5 см, В качестве элюирующего раствора применяют дистиллированную воду. Скорость элюции для препаративных целей 0,3 мл/мин, для аналитических - 0,06 мл/мин, Собирают фракции 2,37 - 2.75 Че/Ч, . Собранные фракции при необходимости дополнительно обессаливают на сефадексе Г.Полученный раствор инсулина можно подвергнуть дальнейшей очистке и получить кристаллический порошок, с этой целью осаждают аморфный цинкинсулин с добавлением 10 /о СНзСОО/2 Хп, доводя рН до 6,0 и осаждая гормон при 4 С в течение 24 ч. Осадок отделяют и растворяют в 0,1 н лимонной кислоте, добавляют 5/о Хп С 1 и ацетон, поддерживая рН 6,0, Процесс кристаллизации продолжают при 4 С в течение 46 ч, после чего отделяют выпавшие кристаллы гормона. Кроме того, оказалось возможным, применяя указанную методику, осадить инсулин и без предварительного отделения балластных белков на колонке, хотя в этом случае степень очистки гормона ниже и не образовывались кристаллы инсулина, выпавший .осадок содержит инсулин,1131507 Составитель В. БрусиловскаяТехред И. Верес Корректор И. ЭрдейиТираж 687 11 олп и с носВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Редактор М. Дылын Заказ 9313/2 Применение этого способа позволяет избежать трудоемкой операции гель-фильтрации на сефадексе.Пример /. 200 мл цельной донорской крови центрифугируют д = 800 в течение 1 О мин. Отделяют плазму, крови. К оставшимся 96 мл эритроцитарной массы добавляют 960 мл изотонического раствора хлористого натрия (9 г ЧаС 1 на 1 л). Смесь центрифугируют при д = 800 в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают. Эритроцитарную массу промывают таким образом три раза. К оставшимся 90 мл эритроцитарной массы добавляют изотони ческий раствор хлористого натрия, содержащий этанол в концентрации 2,5%(2,34 мл) 90 мл. Инкубируют эритроциты при перемешивании 90 мин при 20 С. Отделяют супернатант центрифугированием д = 800 в течение 10 мин и проводят его биохимическое фракционирование путем гель-фильтрации на сефадексе Г, высота колонки 80 см, диаметр 1,5 см, В качестве элюирующего раствора применяют дистиллированную воду. Собирают фракции от 2,37 - 2,75 ЧеЯ Скорость элюции 0,3 мл/мин. Собранные фракции подвергают обессаливанию на сефадексе ГО. Полученный раствор белка высушивают. Вес сухого порошка составлял 115 мг. Радиоиммунологическое определение активности полученного инсулина, проведенное с помощью набора ИРИ производства ВНР, выявило активность, равную 48 мед/мг. Пример 2. 241 мл цельной крови отделяют от плазмы и отмывают физиологическим раствором аналогично примеру 1. Оставшиеся 130 мл эритромассы инкубируют в 130 мл физиологического раствора, содержащего 2,5% этанола (13,04 мл 96 этанола), в течение 120 мин. при перемешивании. Отделяют супернатант. К 120 мл супернатанта добавляют 80 мл раствора, содержащего 20 г СНз (СОО), Хп, доводят рН до 6,0. Полученный осадок растворяют в 50 мл 0,1 н, лимонной кислоты, добавляют0 мл раствора, содержащего 3 г 2 пОСе и ацетона. Доводят рН до 6,0. Кристаллизируют гормон при 4 С в течение 48 ч. Отделяют выпавший осадок гормона и высушивают на воздухе. Всего получено 137 мг сухого вещества с активностью ИРИ 39 мкед/мг.Выделенныйгормон подвергали радиоиммунологическому, иммунологическому и биологическому тестированию, проводили 5 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 определенйя его электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле. В результате проведенного радиоиммунологического определения (ИРИ) и определения биологического эффекта выделенного продукта установлено, что выделенный белок является инсулином.Применение различных способов очистки позволяет получить активность около 40 мкед/мг сухого вещества, что приблизительно в000 раз выше, чем активность целевого продукта, получаемого по известному способу. Биологическое тестирование на белых мышах, основанное на свойстве введенного инсулина вызывать гипогликемические судороги и гибель животных, проведенное с гормоном, выделенным из эритроцитов, подтверждает наличие биологической активности целевого продукта. После инъекции выделенного белка мышам в дозе 3 мг на животное у всех мышей (Ь = 20) через 60 - 90 мин наблюдалось снижение концентрации глюкозы почти вдвое, гипогликемические судороги и на их фоне смерть. Введение нд фоне судорог мышам (и = 10) 20 мг глюкозы прекращало судороги и предупреждало гибель животных.Таким образом, способ позволяет использовать доступное сырье, в промышленных масштдбдх получать человеческий гормон, получение которого другим путем невозможно. Получение человеческого гормона даст возможность создания лекарственного препарата, применение тдкого лекарства позволит избс +,дть широко распространенных ослож 1 ц ний. присущих применяемым сейчас препаратам. Кроме того, возможно на базе предлагаемого способа изготовление стандартных инсулинов для радиоиммунологических наборов, для эндокринологических и биологических исследований.Изготовлениечеловеческого стандартчнсулина для таких наборов, применяемых в медицинских и научных учреждениях, позволит в год экономить до 30 000 р, Разработка ни базе прсдлагаемого способа медицинского препарата инсулина и его применение .;дст общеэкономический эффект до 20014 Ю р, в год.Применение чммунологически присуп 1 его человеку гормона позволит избежать нежелательных осложнений.Пре;1 лагаемый способ прост и экономичен, н требует сложного оборудования, позволяет сохранить плазму и эритроциты крови для целей гематологии.