Способ определения зоны эквивалентности при титровании антител

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН з(5 В А 61 В 1000 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ БИБЛКду ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) 1. Определение абсолютных количествантител и антигенов по методу Гейдельбергера. - В кн.: Иммунохимический анализ,Под ред. Зильбера Л. А. М., Медицина,1967, с. 43 - 53.(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 30 НЫ ЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ПРИ ТИТРО,ЯО 1033125 А ВАНИИ АНТИТЕЛ путем последовательного разведения антигена с последуюгцим добавлением одного и того же количества антител до образования комплекса антиген-антитело, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, надосадочную жидкость комплекса антиген-анти- тело каждого разведения сыворотки переносят в два параллельных ряда пробирок с последующим добавлением в каждый ряд пробирок эритроцитарных антительных и антигенных диагностикумов соответственно и по отсутствию реакции с соответствуюгцнми диагностикумами в параллельных пробирках определяют зону эквивалентности.Изобретение относится к иммунологии и микробиологии, в частности к определению зоны эквивалентности при титровании антител (антигенов), и может быть использовано при контроле иммунизации животных и готовых препаратов сывороток, иммуноглобулинов и моноспецифических антител.Известен способ определения зоны эквивалентности при титровании антител путем последовательного разведения антигена с последующим добавлением одного и того же количества антител и определением зоны эквивалентности по максимальному осадку комплекса антиген-антитело 1.Однако известный способ недостаточно точен, так как в производстве специфических сывороток в основном пользуются относительными способами титрования - бактериально агглютинацией, а титр выражают через максимальное разведение сыворотки, при которой еще есть ясно выраженный агглютинат гомологичной культуры. Целью изобретения является повышение точности способа.Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения зоны эквивалентности при титровании антител путем последовательного разведения антигена с последующим добавлением одного и того же количества антител до образования комплекса антиген-антитело, надосадочную жидкость комплекса антиген-антитело каждого разведения сыворотки переносят в два параллельных ряда пробирок с последующим добавлением в каждый ряд пробирок эритроцитарных антительных и антигенных диагностикумов соответственно и по отсутствию реакции с соответствующими диагностикумами в параллельных пробирках определяют зону эквивалентности.На чертеже представлена схема, реализующая предлагаемый способ.Способ осуществляется следующим образом.В ряд укороченных до 100 мм стандартных химических пробирок (10 шт,) автоматической пипеткой на 1 мл одним наконечником разливают раствор первой фракции чумного микроба (Ф) на 0,15 М растворе МаС с рН 6,2 - 7,3 и 0,02 О/о азида натрия с концентрацией белка в растворе 10 мкг/мл, начиная с 1,0 мл и шагом 0,1 мл, т.е. в первой пробирке будет 1 мл, что равно 10 мкг белка антигена; во второй 0,9 мл, что равно 9 мкг белка антигена и т.д., а в десятой пробирке 0,1 мл, что равно 1 мкг белка антигена. Меняют наконечник автоматической пипетки и объем растворов во всех пробирках доводят до 1 мл 0,15 М раствором ХаС с рН 7,2 - 7,3 и 0,02/О азида натрия. Содержимое пробирок аккуратно смешивают, в каждую пробирку добавляют автоматической пипеткой (одним наконечником) 1 мл инактивированной при 56 С в течение 30 мин противочумной коммерческой лошадиной сыворотки, которая предварительно количественно разведена в 100 раз 0,015 М раствором МаС с 0,02/о азида натрия и рН 7,2 - ,3. Содержимое пробирок тщательно, осторожно смешивают, обрезы пробирок заклеивают водонепроницаемой пленкой, 2 ч выдерживают при 3+- О + 0,1 С и 48 - 72 ч при 4+ 1 С. Два разав день содержимое пробирок осторожно перемешивают. По истечении указанного срока все пробирки осторожно центрифугируют 30 мин известным способом при 2 - 4 С (например на крестовом роторе ЦЛР - 1 при 500 - 600 об/мин). Обрезы пробирок осторожно расклеивают и, меняя после каждой пробирки наконечник автоматической пипетки, выносят по 0,5 мл супернатантов комплекса Аг-Ат в свою лунку агглютинаци онной доски, т.е. из первой пробирки в лунку А в 1, из второй пробирки в лунку А - 2 и т.д. В эти же лунки добавляют по 0,5 мл нормальной кроличьей инактивированной сыворотки (НКС) в разведении 1:100 на 0,15 М растворе МаС с рН 7,2 - 7,3. Содержимое лунок тщательно смешивают и из каждой лунки ряда А переносят 0,5 мл в лунку ряда В (менять наКонечники после каждой лунки ряда А), т.е. из А, в лунку В ь из А 2 в лунку В и т.д. Лунки А, А и В, В, для обычного контроля диагности кум о в.Таким образом, получено два одинаковых ряда - А = В, В ряд А закапывают по 1 капле 2,5/,-ной суспензии эритроцитов, сенсибилизированных первой фракцией чумного микроба (т.е. ищется избыток антител), а в ряд В по 1 капле 2,5 О/,-ной суспензии эритроцитов, сенсибилизированных иммуноглобулином из коммерческой противочумной сыворотки (т.е. ищется избыток антигена), Доску осторожно встряхивают и 40 оставляют на столе на 2 ч при комнатнойтемпературе. При визуальном учете сравнивают ряды А и В. Легко заметить две вертикальные лунки в этих рядах, где отрицательная реакция как с эритроцитами с Ф, чумного микроба, так и с антительными эритроцитами, т.е. в пробирке с соответствующим номером лунки выдерживается условие, что в зоне эквивалентности в надосадочной жидкости нет ни антигена, ни антител.Пример. Формализованные эритроцитыбарана сенсибилизируют первой фракцией чумного микроба ЕВ 76 линии НИИЭГ и иммуноглобулином коммерческой противочумной агглютинирующей лошадиной сыворотки серии 109 производства Саратовского НИИ Микроб по стандартной методике. Комплекс антиген-антитело получают постандартной методике Гейдельбер гера пу1033125 Составитель Г. КрюковаТехред И. Верес Корректор Л. БокгпапТираж 713 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Редактор М. ДылынЗаказ 5466/6 тем разведения первой фракции чумного микроба до концентрации О, 9 и 8 мкг/мл и т.д. до 1 мкг/мл. Белок. определяют во всех случаях по методу Лоури на ФЭК М. Сыворотку серии 109 используют в разведении 1;100 (инактивированную прогреванием при 56 С в течение 30 мин), Смесь по 1 мл антигена указанных концентраций. и по 1 мл сыворотки серии 109 в разведении 1:100 прогревают 2 ч при 37 С и выдерживают 72 ч при 3 С с периодическим перемешиванием. Определение зоны эквивалентности реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) производят согласно описанию в разделе осуществления способа на стандартной агглютинационной доске с супернатантами комплекса антиген-антитело и анти- генными, антительными эритроцитарными диагностикумами. Учет результатов производят через 2 ч. Только в лунках А - 2 с эритроцитами, сенсибилизированными первой фракцией, и Вс эритроцитами, сенсибилизированными иммуноглобулином, реакция отрицательная одновременно, т.е. вэтом участке находятся зона эквивалентности, где в надосадочной жидкости цет ни антител, ни антигеца. Таким образом, общее количество белка в сыворотке серии 09 содержится 100 мг 1 мл (10 гр.,о), колнчс гво антител к первой фракции чумного микроба 15 мг/мл, отношение ацтцгсц-эцтцтело в зоне эквивалентно 1 н приблизительно 1:17, титр сыворотки к первой фракции чумного микроба 900 мкг/мл. Время для обцдружения зоны эквивалентности согласно предлагаемому способу о цэчалд цосгацовки РПГА до ее учета рдвцо 2 чмиц. Таким образом, предложенный способпозволяет с большей точностью (в 210 рдз) 15осуществлять определение зоны эквивалентности, что имеет большое теоретическое н практическое значение при определении аффинитета антител, как мере их авидцости, валентности антител, црц определении динамики образования неполных антител прн иммунизации животных ц человека, при анализе препаратов моцоспеццфических антител, полученных методом аффицной хроматографии.