Способ определения активности фенолоксидаз

СОЮЗ СОВЕТСОЦИАЛИСТИЧРЕСПУБЛИК ИТЕТ СССР ОТМЪТИЙ 1 ТЕНИН, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ К ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕН ИСАНИЕВТОРСНОМУ Св ЕТЕЛЬСТВ(71) Научно-исследовательский институтбиологии при Иркутском государственномуниверситете им, А. А. Жданова(56) 1, Ас+о СЪее Бсцид,1967, 21, 2367-2378,2, Авторское свидетельство СССРИу 706771, кл. 801 Й 33/54, 1978ВО.1 о 2 2(54)(57) 1, СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯАКГИВНОСТИ ФЕНОЛОКСИДАЗ, включающий обработку пробы фенольным субстратом и измерение люминесценции реакционной смеси, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью расширения класса определяемых фенолоксидаз, обработку пробысубстратом ведут в присутствии суспензия светящихся бактерий ВеиесКеаЪогч еч 1,2,Способпоп, 1, отличающ и й с я тем, что, обработку пробысубстратом ведут при рН 6-8,низкая чувствительность и невозможность измерения в мутных растворах.Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ определения активности полифенолоксидазы путем обработки исследуемой пробы Ьенольным субстратом - экскулетином и измерения люминесценции, Обычно обработку пробы ведут при рН 6,8-8,0,Способ основан на использовании люминесцирующего субстрата-эскулетина и спектрато люминесценции, Активность при атом характеризуется величиной снижения интенсивности свечении при 465-480 нм в интервале 5-10 мин при воздействиимг ферментного препарата 1 2.ЗОНедостатком известного способа явВ табл. 1 дана интенсивность свечеь 5 ния бактерий в присутствии фенолов и после введения фермента,В табл. 2 показана активность фенолоксидаз ( Ь ма за 2-3 с 1 мг ферменте) Изобретение относится к аналитической химики, в частности к способам определения активности фенолоксидазных ферментов, и может быть использовано в лабораторной практике, медицине, пищевой промышленности,Известен способ определения активности фенолоксидаз путем обработки исследуемой пробь 1 субстратом и спектрофотометрирования, Активность выражается в увеличении поглощения при длинах волн, соответствующих продуктам окисления ГЦ.Недостатком этого способа являются ляется то, что он пригоден для определе,леппя только одного фермента.Пель изобретения - расширение классаопрея оляемых фенолоксидаз 35Указанная цель достигается тем,-;то согласно способу определения активности фенолоксидаз, включающему обработку анализируемой пробы фенольнымсубстратом и измерение люминесценции 40реакционной смеси, обработку пробысубстраток: ведут в присутствии суспензия светящихся бактерий ЭВЕРС КРОг.О 4 РЛ.Кроме того, обработку пробы субстра 45том обычно ведут при рН 6-8,Способ осуществляется следующим образомБ суспенжпо светящихся бактерий -,Е 1 ЕС 1;рс ЬСИ-ЧЕМ вводят исследуемуо фенолокспдазу (О-дифенолоксидазу 1 ли о-дифенолоксидазу) и ее субстрат ,.1:" - или О -дифенол). Через 2-3 с после введения по шкале гальванометра М, соединенного с фотоэлектронным ";Иожителем (ФЭУ), регистрируют снижение свечечия бактерий за счет ппибирования их хиноидными продуктами ферментативного окисления, Отмечаемоегашение интенсивности свечения служитмерой активности фермента.Интенсивность свечения бактерий принимают за 100 ма, За единицу фенолоксидазной активности принято изменениеинтенсивности свечения бактерий (в процентах) одним мг белкого препарата за2-3 с.Короткий период проявления реакции( 2-3 с) позволяет определять начальнуюактивность фенолоксидазсохраняющихсяв нативном виде, что невозможно приболее длительных периодах определенияиз-аа изменения фенолоксидаз лод действием образующихся хинонов, что позволяет сделать более строгое заключениео феполоксидазной активности различныхбелковых препаратов,Предлагаемый способ позволяет расширить класс определяемых фенолоксидазных ферментов, так как в отличие от известного в качестве субстрата можно использовать не только экскулетин но ипирокатехини гидрохинон, которые являются значительно более универсальнымисубстратамп для окисления значительнобольшими числом фенолоксидазных препаратов,Способ позволяет также расширитьобласть рН, в которой возможно определение фенолоксидазной активности,что дает возможность увеличить количество определяемых фенолоксидаз за счетферментов, имеющих максимум активностипри рН 6-6,5,По сравнению(с известным способомопределяется интенсивность свечения несамого субстрата, а постоянного биологического объекта, чувствительного кхинону.П р и м е р, В термостатируемуюкамеру установки, состоящей из фЭУ и гальванометра М, помешают стеклянную кювету с 1 мл суспензии клеток ВЕиЕсМрд МдгуВр концентрации500 10 клеток/мл и 0,1 мл раствора6фенола в фосфатном буфере. В кювету приперемешивании вводят 0,1 мл растворафермента с концентрацией 1 г на 100 млоуфера. По шкале гальванометра в течение 2-3 с после введения фермента фиксируютизменение интенсивности свечения.1027208 Табл 1 10 76 80,5 25,5 5,10 5 80,8 37,7 23,2 1 10 93 100 аблица 2 1 10 ф5 10 57,6 1.1050 Таблица 3 60 7,2 8,0 8,5 38 ВНИИПИ Заказ 4672/28 Тираж 523 Подписное Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул, Проектная, 34 при различных исходных концентрацияхфенола.И табл. 3 дана активность фенолоксидазпри различных рН (Ь ма за 2-3 с 1 мгфермента), концентрация фенола 110 М,Таким образом, предлагаемый способпозволяет расширить класс определяемыхфенолоксидаз, повысить експрессностьопределения так как, время определенияуменьшается с 5 10 мин до 2-3 с).