Способ определения активности l-глутаматдекарбоксилазы в биологической пробе

(51) М. Кл. С 12 К 9/14 Гаеудврстваивый кенитвт СССР Ав делан изабретеиий и открытий(72) Авторы изобретения В, К. Поздеев и А. П, Ильин Ордена Трудового Красного Знамени науч оисследовательский институт экспериментальной медицины ЛНН СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ 6 -ГЛУТАМАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЕ Изобретение относится к медицинеи может быть использовано для диагностики и контроля за рез,льтатами лечения заболеваний нероыой системы.Известен способ определения активности 3-глутаматдекарбоксилазы в биологической пробе путем гомогенизацииее в фосфатном буфере с последующим внесением в гомогенат пиридоксальфосфатаи глутаминовой кислоты,инкубации его,1 Ообработки кислотой, отделения образовавшегося осадка и добавления нингидрина (1.Однако известный способ не обеспечивает высокой точности и чувствитель 15ности способа,Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа,Эта цель достигается тем, что вспособе определения активности 1-глу 10таматдекарбоксилазы в биологическойпробе путем гомогенизации ее в фосфатном буфере с последующим внесением в гомогенат. пиридоксальфосфата и глутаминовой кислоты, инкубации его, обработки кислотой, отделения образовавшегося. осадка и аобавпния нингидрина, гомогенат после инкубации обрабатывают хлорной кислотой, далее смесь нейтрализуют, после отделенияосадка супернататхроматографируют на катионообменнике, имеющем 8 сшивки,затем последовательно элюируют цитратным буфером с концентрациями 0,2 и 0,35 н.и после добавления в элюат нингидрина его колориметрируют,Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.100 мг ткани мозга гомогенизируют в Ха-фосфатном буфере рН 6,4, содержащем тритон Х и меркаптоэтанол, Затем часть гомогената термостатируют с пиридоксальфосфатом, далее добавляют 3-глутаминовую кислоту и повторно термостатируют, Остановку энзи- матической реакции и одновременно депротеинизацию смеси осуществляют добавлением хлорной кислоты. Центри) Е 001 АктивностьГДК, цИ/гткани ГАМКза 0,5 ч Экстинкция После энзиматической реакции Структура мозга оновогоопыта Варольев мост 0,04 0,145 3,56 0,088 0,19 Средний мозгМозжечок 0,07 0,19 4,07 0,038 0,047 0,042 О, 185 5,0 Передний мозгПродолговатый мозгГипоталамус 0,2 5,2 0,21 5,7 0,06 0,24 6,1 Стриопаллидарнаясистема 0,08 0,62 18,3 0,062 Целый мозг 0,26 6,7 где Г - экстинкция пика ГАМК, полуценная после энзиматическойреакции;6- экстинкция пика ГАИК в фоновом опыте; Гиппокам, миндалинаи височная доля1,структуры объединены) В отличие от известного предлагаемый способ при той же чувствительности более специфичен, не требует специального помещения, оборудова 45 ния и меченых реактивов, которые не только дороги и требуют осторожности в работе, но и потому, что биохимические реакции с их использованием идут йначе, нежели в естественных условиях.Предлагаемый способ не зависит от колебаний температуры и давления, по сравнению со способами определения активности ГДК по выделению газообразного СО, объем которого находится в прямой зависимости от этих величин. б0,3 - количество мМ ГАИК, помещаеиое на колонку в калибровочных опытах;- средняя экстинкция пикаГАМК, получаемая в калибровочных опытах;0,0 1 - количество ткани в г, взятое для энзиматическойреакции,Данные предлагаемого способа активности глутаматдекарбоксилазы в различных о"ластях головного мозга белых крысВ - 0,88) представлены в таблице. Предлагаемый способ позволяет определять не только активность ГДК, но и то количество ГАИК продукта этой реакции), которое присутствует в ткани в свободном гостоянии. Это позволяет делать чрезвычайно важные выводы об интенсивности функционирования ГАМК-ергической медиаторной системы.Предлагаемый способ недорог, относительно прост, доступен, безвреден, использует широко распространенные отечественные реактивы и оборудование, не требует специального помещения и дополнительной подготовки персонала, потому может быть внедрен как в экспериментальную био