Штамм, используемый как тест-объект для отбора химических соединений, активных в отношении нитрофураноустойчивых микроорганизмов

2 Н 15 00 ЕТЕНИЯ свидетельств ГОСЗЯАРСТОЕННМЙ КОМИТЕТ СССР 110 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ, (71) Саратовский ордена ТрудовогоКрасного Знаиени государственныймедюрнскнй институт., (54) ШТАММ .БЯСЧЕНХСНХА СОМ.И 12/р0105/ ИСПОЛЬЗЯИЫЙ КАК ТЕСТОБЬЕКТ ДНЯ ОТБОРА ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ АКТИВНЫХ П. ОТНОШЕНИИ НИТРОФУРАНОУСТОЙЧИНЙХ МИКРООРГАНИЗМОВ, (57 Штамм БвсЬеЫсМа соХХ К 12 ./рХ 0105/,.ЦМЩ 43-2164 (ЪНИИГенвтикаф), . используемый ка тест-объект ля отбора химических. соединений, активных в отвоюении Фураноустойчивйх микроорганизмов.Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма микроорганизмов, используемых для отбора эффективных химиотерапевтическихпрепаратов, активных против нитрофуранореэистентных бактерий, 5Известен штамм Е ь с Ье г 1 сЬ 1 в со 11Кс 85,несущий трансмиссивные Й-плаэмиды (йбК,рЯА 5082, рА 5017, р А 4733или(р 3 А 4320)(1).Однако известный штамМ обладаетОмножес.венным характером трансмиссион.,ной лекарственной усгойчивости,приэтом Н-факторы наряду с детерминан-тами нитрофуранорезистентности несут маркеры устойчивости и к другим антибактериальным препаратам.Цель изобретения - создание штамма .ЕзсЬегхсМа( со 11 К 12/р 10105/обладающего такой степенью трансмиссивной устойчивости к препаратамнитрофуранового ряда, котораяпозволяет использовать его как тестобъект для отбора химических соединений, активныхв отношении нитроФураноустойчивых микроорганизмов.Штамь; ЕэсЬег 1 сМа со 11 К 12./рЖ 105/ получей методом конъюгации музейного штамма Евсее.г 1 сЬ 1 а 1,со 11 К 12 э 1 г" и клинического штам,ма .ЕэсЬег 1 сЫ.а 1 со 11 92 йс"йд"Хг "и последующей селекции трансконъюгантов на среде с фурангином(20 мкгмл) .Штамм хранится в Центральном музеепромышленных микроорганизмов института ффВНИИГенетиаф под номерсм 35ЦМПМВ,Штамм Е.со 11 К 12/рЫ)105/ характеризуется следующими свойствами.Морфологические признаки.Клетки суточной культуры пряМые 40палочковидные размера (2-5)х(0,5-/0,7)мк ,подвижные,грамотрицательныеКультуральные свойства,Прототрофный штамм, хорошо растет 45на простых питательных средах,Мясо-пептонный агар: колонии вОВ-форме, неправильные, плоские,крупные (3-5) мк с .плотным центром и.прозрачные по периферии. Поверхность шеро- Оховатая, край фестончатый, структуразернистая, консистенция рыхлая. Насреде Эндо образует подобные колониис металлическим блеском. Мясо-пептонный бульон: крошковидный придонныйрост, пленка на поверхности, просветление среды.Ьиохимические свойства.Дает положительную реакцию с метиловым красным, не образует ацетилметилкарбинол Не утилизирует цитрат, Ферментирует глюкозу,лактозу,маннит, мальтозу, дульцит, сорбит,арабчнозу, рамнозу, ксилозу,глицерин, не ферментирует сахарозу, инозит, раффинозу, желатич не разжижает. 65 Образует индол, не образует сероводорода, не расщепляет мочевйну.Декарбоксилирует лизин, глутаминовую кислоту и не активен в отношении аргиниюа орнитина и фенилаланина.Не обладает антагонистической йгемолитической активностью.Полученный штамм Е.со 13. К 12/рЬ 0105/ может быть практически использован как тест-объект для отборахимических соединений, активных вотношении нитрофураноустойчивых микроорганизмов в ограничивающих распространение этого признака, а такжедля конструирования штаммов бактерийдругих видов с плазмидной устойчивостью этого типа.Плаэмида р 00105 обладает Р 1 п Фенотипом. Клетки штамма Е.со 11 К 12,воспринявшие ее при конъюгации, приобретают донорную активность, хотяхарактеризуются нечувствительностьюк Фагам Р,Ь,р,специфичным для штаммовс плазмидами 1 пс,Р,1 пс,1 псР групп.Они передают признаки Рс (фурацилин),Гд (фурагйн),Рк (фуразолидон) приповторном скрещивании реципиентномуштамму Е.со 11 В с частотой, сравнимой с частотой передачи тийичныхВ-плаэмид (табл. 1) .Вместе с маркерами нитрофураноустойчивости наблюдается перенос ихромосомных генов донора, контролирующих синтез аминокислот (1 ец,ргосгррЫэ р 1 уз р 3.1 ч),Плазмиды, контролирующие устойчивость к производным 5-нитрофурана,стабильно сохраняются штаммом Е.со 11К 12 /рЬ 0105/ в течение четырех летпри поддержании микроорганизма насреде без соответствующих препара"тов при 4 С. Популяционный анализштамма в отношении чувствительностик фурацилину., фурагину и фуразолидону выявлет незначительную спонтаннуюпотерю указанных детерминант. Элиминация плазмид может быть усиленаакрифлави,;ем,Выделение плазмидной ДНК из полученного штамма осуществляют с помощью метода центрифугирования вградиенте плотности хлористого цезия,Анализ образца плазмидной ДНК,вьщеляемей из штаммов Е.со 11 К 12/рЬ 0105/, обнаруживают присутствиетрех групп плазмид; основной с мол.весом 30,7+0,81 мегадальтон,дополнительной - 33,9+0,2 МД, кроме того,выделяется ряд молекул с мол,весом8,9 - 10,1 МД.П р и м е р 1.уровни устойчивости к нитрофурановым препаратамопределяют методом серийных разведений в плотной питательной среде. Изучаемые химические соединения (Я-алкилсульфониевые соли 2"тиабициклоалканов) растворяют предварительнов диметилформамиде, а затем разводят.1018972 Составитель П.БонарцевРедактор Р.Цицкка ТекредМ.Костик Корректор О. Билак Заказ 3636/20 Тираж 523 . . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета. СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 в мясо-пептонном бульоне. В качестве тест-культуры используют штамм ЕзсЬет 1 сп 1 а со 11 К 12/рЬР 105/.П;р и м е р 2. Конструирование штаммов бактерий е плазмидной устойчивостью к нктрофуранам. 5Штамм Е.со 11 К 12/РЬР 105/ используют,в качестве донора в опытах конъюгационного переноса признака нитрофураиорезистентности. Реципиентом служит штамм Е.со 11 В,чувствктельный к нитрофуранам, Суточные бульонные культуры донорного и рецкпиентногоштаммов разводят с.вбежим мясо-пептонным бульоном в 10 раз и кнкубкруют при 37 С. Культуры, взятые в фазе логарифмического роста,смешивают в отношении 1:10. После 20-часовой.ин кубации конъюгацконной смеси прк 37 С отбирают пробы (0,5 мл), которые высевают иа мясо-пептоккый агар, содер- жашкй фурагин к фураэолидон в концентрации 20 мкг/мл н рифампицин - 500 мкг/мп, Учет результатов проводят через 48 ч инкубации пОсевов при 37 фС. Частота формирования траксконъюгантов не зависит от селектквкого агентаи сравнима с частотой передачи типичных Р-плаэмид. П р и м е р 3. Мобилизация хромосомных генов.Мобилизацию генов, контролирующих синтез аминокислот, изучают у пред- лагаемого протрофного штамма Е,со 11 К 12/рХР 105/Г В в кроссах с рецики ентными полиауксотрофными Ц -щтам мами Е.со 11 3 62 и КВ/4, Конъюгацию осуществляюто описанной методкке (пример 2)Рекомбинатм по хромосомным маркерам 1 еи,рго,дарг,Ыэ, ,ув,)ч селекционируют ка минимальной среуе Ледерберга е рифампицкном (50 С мкг/мл) и соответствующими аминокислотами (20 мкг/мл), Перенос хромосомных генов В-плаэмидой рьР 105 рецепиеиткым штаммам в о исанкых условиях опыта осуществляет ся с частотой 10 - 10 на клетку реципиента.Таким, образом, предлагаемый штамм Е.со 11 К 12/рЬО 105/ несет трансмиссконную плазмиду нитрофуранорезкстентности, контролирующую устойчивость к группе соединений,не имеющих аналогов в природе, что выгодно отличает ее от других й-плазмид и делает перспективной векторной системой в генной инженерии.