Способ выделения метилазы есо ri из еsснеriснiа coli

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРЕСпублик лц 929705(22) Заявлено .110980 (21) 2985387/28-13с присоединением заявки Мо(Я 11 М Кп 3 С 12 Я 1/02 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(088.8) Дата опубликования описания 2305,82(71) Заявител нститу АН СССР охимии зиологии ми ргани 54) СПОСОБ ВЦЦЕЛЕНИЯ МЕТИЛАЗ ИЗ ЕБСНЕВ 1 СН 1 А СОН сульфат а аммони я, концен три руют сульфатом аммония, осадок растворяют в буферном растворе и диализуют, диализат хроматографируют на колонках с фосфоцеллюлозой Р, гидроксилаппатитом, фракции, содержащие метилазу Есо В 1,диализуют, концентрируют на колонке с гидроксилаппатитом и подвергают гельфильтрации на колонке с В 1 о-Се 1-0,5 в, препарат фермента концентрируют диализом против раствора с 50-ным глицерином. Выход 16, удельная активность 7,500-, 8,000 ед/мг белка 2).Недостат ба явля ется низкий продукта и наличие б ва трудоемких стади ками этого спосо выход целевогоольшого количестй е ь - та продук и ускления.Указанная цчто в способе5 Есо Н 1 из Еясйривающем дезинрование сульфацентрированиедиализ, послеО ционированиен тигается тем,ия метилазы со 11,предусматю, фракциониептомицин а, коном аммония ипроводят фракках с полиэтилен ыделе 1 сй 1 грац ом ст льфа ализ коло Изобретение относится к способам выделения ферментов, а именно к способам выделения высокоочищенных ДНК метилаз, которые находят применение в экспериментах по изучению структуры и функции ДНК и в генной инженерииИзвестно несколько методов выделения метилазы Есо Н 1.Они основаны на Фракционировании белков с помощью сульфата стрептомицина, сульфата аммония, ионообменной хроматографии и позволяют получать высокоочищенные препараты 1.Однако эти методы трудоемки, длительны и дают низкий выход фермента,Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ выделения метилазы Есо 21 из Еясйег 1 сЬ 1 а со 11, предусматривающий дезинтеграцию, Фракционирование сульфатом стрептомицина, концентрирование сульфатом аммония и диализ.В этом способе в качестве источника фермента используют клетки Еяспег 1 спа со 11 ВХ 13. После дезинтеграции клеток и последующего центрифугирования белки неочищенного экстракта фракционируют сульфатом стрептомицина, осадки экстрагируют растворами различных концентраций ичение выхода целево орение процесса выде929705 Формула и зоб ретени я С ос т ави тель В . Мур он ецТехред 3. Фанта Корректор А.Дзятко Редактор Н.ГунькоЭаказ 3415/35 Тираж 505 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 ФИлиал ППППатент , г.ужгород, ул.Проектная,4 имин-агарозой, гепарин-агарозой и фос"фоцеллюлозой Р.За единицу активности принимаютколичество Фермента, необходимогодля переноса 1 рво 1 метильной группыметиладенозинметионина на ДНК в течение 1 мин, при 37 С.Препарат фермента не содержит эк.зонуклеаз, на что указывает полноесохранение дезоксинуклеотидной последовательности ДНК и суперспиральной (ОФормы плазмидной ДНК при длительнойинкубации (10 ч) избыточных количествфермента (10-20 ед,) с фрагментамиДНК (1 мкг) и плазмидной ДНК (рВК 322)в условиях, способствующих действиюнуклеаз .(в присутствии ионов Мф )Это позволяет использовать его в эк-, ,спериментах по молекулярно-биологичес.кому конструированию рекомбинатныхДНК Хп У 11 го,П р и м е р. Еясйег 1 сМа со 11К29 выращивают до .титра 6-7 х 10 бактериальных тел в мл при 37 ОС с интенсивной .аэрацией на среде следующего состава, г/л: пептон; дрожжевой экстракт 5; БаС 1 10; глюкоза 2. Клеткиотделяют центрифугированием. Все дальнейшие операции проводят на холодуот 0 до 5 С).Биомассу (10 г) дезинтегрируют вбуфере А (20 мМ калий фосфат, 7 мМ 302-меркаптоэтанол, 1 мМ ЕДТА, рН 7,0)для получения белкового экстракта, аклеточные стенки отделяют центрифугированием. Осадок отбрасываютСупернатант фракционируют. сульФатом 35стрептомицина и концентрируют сульфа.том аммония (70 насыщения) . Осадокрастворяют в буфере В (20 мМ калийфосфат, 20 мМ 2-меркаптоэтанол,0,5 ми ЕДТА, 10 глицерин, рН 7,4) с 400,2 М КС 1 и диализуют против этого же,буферного раствора (6 ч) . Диализатнаносят на колонку с полиэтилениминагарозой (5 Мя) (полиэтиленимин, ковалентно пришитый к агарозе) промывают буфером В с 0,2 М КС 1 и элюируют0,5 М КС 1, Элюат разбавляют в .2,5 ра за буфером В и пропускают через колонку с гепарин-агарозой (2 мл)гепарин,ковалентно пришит к агарозе. Фракции,содержащие не сорбировавшийся на смолу белок наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р(0,5 мп), промываютбуфером В с 0,2 м КС 1 и элюируют0,45 м КС 1. Элюат, содержащий метилазу Есо К 1, диализуют против 50 глицерина в буферном растворе (20 ьИ калий фосфат, 0,25 М КС 1, 1 мМ ЕДТА, 2,5 мМ дитиотреитол) .Выход целевого продукта 30-35, удельная активность 8000 ед/мг белка.Таким образом, предлагаемый способ очистки позволяет получить препарат метилазы Есо К 1 с выходом, превышающим в два раза выход конечного препарата по сравнению с описанными спосо-. бами очистки при той же удельной активности (7500-8000 ед/мг белка) . Пре- парат фермента свободен от экзонуклеаз, эндонукйеаз, что позволяет его ис" пользовать в экспериментах по генной инженерииСокращено число стадий и время выделения благодаря исключению из процесса очистки стадий экстракции раствором сульфата аммония, концентри- рования на колонке с гидроксилаппатитом, а также замене стандартных методов хроматографирования методами фракционирования на новых более избирательных сорбентах, позволяющих исключить стадии диализа в процессе фракционирования белков на колонках.Способ может быть использован для получения метилазы Есо К 1, необходимой для экспериментов по генной инженерии. Способ выделения метилазы Есо К 1из Еясйег 1 сП 1 а со 11, предусматривающийдезинтеграцию, фракционирование сульфатом стрептомицин а, концентриров аниесульфатом аммония и диализ, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения выхода фермента и ускоренияпроцесса выцеления, после диализапроводят Фракционирование на колонкахс полизтиленимин-агарозой, гепаринагарозой и фосфоцеллюлозой Р Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. 6 гееп Р. д. е 1 а 1. Кеягг 1 с(:акопапй МоЖЕ 1 са 11 оп оХ а Бе 1 Й в Совр 1 евеп 1 агу Осгапцс 1 еа 1 Ые Сопга 1 п 1 пд Ж)еЕсо К 1 ЯцЬягга 1 е. - Тйе Юоцгпа 1 ой Мо 1 есц 1 аг В 1 о 1 оду, 1973, 99,237-261.2. КцЬ.п К.А. Мойг 1 сЬ Р, Есо К 1Мегпу 1 аяе. Рпуя 1 са 1 апй Саа 1 ус Ргорег 11 ея ой 1 Ье Новодепоця епдуве. -ТЬе доцгпа 1 ой В 1 о 1 од 1 са 1 Сйевз.янгу,1977, 252, В 20, 7265-7272.1