Способ получения щелочной протеазы

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветснмхСоциалистическихРеслублик и 749891па делам нзебретеннй н атхрмтнйДата опубликования описания 28.07.80 3. Г. Медведев, В. В. Дорохов, В. Г, Халабузарь, Э. В. Кузнецов,Л, Б. Носкова и Л. М, Вайнер(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ ф1Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения щелочной протеазы.Известен способ получения щелочной протеазы, предусматривающий культивирование бактерий рода Вас 11 цз на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли, а также глутаминовую кислоту и лизин в качестве стимуляторов биосинтеза щелочной протеазы с последующим выделением конечного продукта 1.Недостатком известного способа является низкий выход щелочной протеазы, который составляет 1660 ед/мл по методике ФОЛИ. Цель изобретения - повышение выхода фермента.Указанная цель достигается тем, что в качестве стимулятора биосинтеза щелочной протеазы используют содержащие глутаминовую кислоту и лизин клетки продуцента, полученные после 24-48 ч культивирования, которые предварительно подвергают .тепловой обработке сначала при температуре 30 160 С в течение 30 - 60 мин, затем при 2температуре 40 - 60 С и рН 7 - 10 в течение 3 - 6 ч в присутствии нейтральной протеазы.. Клетки продуцента после 24-48 ч культивирования содержат большое количество, а именно 20 - 60 О/О от суммы всех аминокислот, глутаминовой кислоты и лизина,.чем и обусловлено стимулирующее действие гидролизата продуцента на биосинтез щелочной протеазы В качестве продуцентов щелочной протеазы используют бактерии из группы Вас 1 цз цЫ 1 в - Вас 111 цз птезеп(ег 1 дпз.то . Пример. Культуральную жидкость Вас 1- ив вцЫ 11 з 12, полученную в производственном ферментере после выращивания в течение 36 - 48 ч. направляют на сепарацию, где отделяют клетки продуцента. С ферментера, емкостью 6 м, после сепарации получают 4,0 мз клеток продуцента и часть культу.ральной жидкости.Смесь клеток продуцента и культуральной жидкости загружают в сборник емкостью 6,3 мз, где ее обрабатывают при тем 2 в пературе 135 С в течение 60 мин. Послетермообработки смесь охлаждают до температуры 50 С, доводят с помощью щелочи до рН 8,0, добавляют нейтральную протеазу из расчета О,25 ед/л удельной активно.749891 формула изобретения 3стй (по методу Ансона-Мирского) ипри постоянном перемешивании выдерживают смесь в течение 5 ч.Полученный гидролизатнапхавлязют в.сборник, емкостью 63 мдобавляют 19,2 кг бактериальной амилазы, перемешивают и вносят 3840 кг крахмала, 960 кг кукурузной муки, 192 кг белково-витаминного концентрата, 32 кг фосфорнокислого двузамещенного аммония и пеногаситель. После чего рН раствора доводят до 6,4, и нагревают до 75 С, Раствор стерилизуют и подают в ферментер, емкостью 63 мз.В отдельной емкости готовят раствор технического казеина. Наливают 8 м воды, доводят рН до 1 О и вносят 320 .кг техни ческого казеина. Температуру раствора поднимают до 50 С и перемешивают в течение 60 мин. Раствор стерилизуют и подают в ферментер. После стерилизации в реактор наливают 2000 л воды, промывные воды стерилизуют и направляют в ферментер. Объем среды и ферментере 31;5 мз; рН среды в ферментере доводят до 6,8, производят посев и, ведут культивирование при постоянном перемешивании и аэрировании в течение 36 чАктивность культуральной жидкости в конце ферментации 15300 ед/мл (пометоду ФОЛП).Способ получения щелочной прбтеазы сиспользованием в качестве стимулятора био.синтеза фермента гидролизата клеток продуцеита с высоким содержанием глутаминовой кислоты и лизина позволяет увеличить выход конечного пРодУкта на 30 о/о.эСпособ получения щелочной протеазы,предусматривающий культивирование бактерий рода Васцэ на питательной среде,содержащей источники углерода, азота, фос-.фора, минеральные соли, а также глутами 1 в новую кислоту и лизин в качестве стимуляторов биосиитеза .щелочной протеазы с по.следующим выделением конечного продукта,отличаюиийся тем, что, с целью повышения выхода фермента, в качестве стимуля 4 Э.тора биосинтеза щелочной протеазы используют содержащие глутаминовую кислоту илизин клетки продуцента, полученные после24 - 48 ч культивирования, которые предварительно подвергают тепловой обработкесначала при температуре 30 - 160 С и те.чение 30 - 60 мин, затем при температуре40 - 60 С и рН 7 - О в течение 3 - б ч вприсутствии нейтральной протеазы,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Емцева Т. В. Физиолого-биохимическиеисследования экспериментально полученного мутанта Васцэ аеэеп 1 егсцз и природного штамма Вас цэ эцЬИэ - продуцен. тов протеолитических ферментов. Автореф.дис, М МГУ, 1975, с. 12.эоСоставитель Т. Мелентьева Редактор В, Зарванская Техред К. Шуфрнч Корректор В. Синицкая Заказ 4428/8Тираж 522Подписное ЦНИИПИ ГосумГарсЧВЖного" комитета СССР по делам изобретений и открытий 313035, Москва, Ж - 35, Раушская иаб., д,4/5 Филиал ППП Патент, г, Ужгород, тл, Проектная. 4