Способ получения 6-оксиметил-2нафтойной кислоты

ОПИСАНИЕ ИЗО БР ЕТЕ Н И Я700540 Союз Советских Социалистических Республикпо делам изобретении и открытий(45) Дата опублнковани писания 30.10.( 72) Авторы изобретения ойтов, А, М. Бороглебская, Старов Борисо физиол АН ССС Г. К. Скрябин, И. иА,нститут биохимии) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ -НАФТОЙНОЙ КИ 1Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения 6-оксиметил-нафтойной кислоты, используемой для получения волокно- образующих полиэфиров (полимеров), обладающих высокой прочностью и термостойкостью.Известен способ получения 6-оксиметил- -2-нафтойной кислоты путем окисления 2,6- диметилнафталина с помощью микроорганизмов вида Рзецс 1 огпопаз рцЫа, выращенных на минерально-солевой среде 1 П.Недостатком этого способа является длительность процесса, составляющая минимально 100 ч.Цель изобретения - упрощение процесса благодаря сокращению времени его проведения.Поставленная цель достигается тем, что из вида Рвецдогпопаз рц 1 Ыа используют штамм Рзецдогпопаз рц 1 Ыа ВЯ 225.Штамм Рз. рц 1 Ыа В 5 225 является двойным мутантом, полученным на основе штамма ВЬ 202 (прежнее обозначение 2-А). У штамма ВЯ 202 был выделен делеционный мутант по салицилатгидроксилазе. У этого штамма (ВЯ 213) была получена мутация по плазмиде ХР 1.-1, обусловливающая конститутивный синтез ферментов окисления нафталина до салициловой кислоты. Таким образом был получен штамм Рз. рц 1 Ыа ВЯ 225, растущий на нафталине, но нс растущ;:и на салицилате в качсствс единственного источника углерода,5 Наличие мутации по плазмиде МР 1.-1 уштамма Рз. рц 1 Ыа ВЬ 225 обусловливает также конститутивный синтез ферментов, участвующих в окислении 2,6-диметилнафталина с образованием 6-оксиметил-наф тойной кислоты. Вследствие этого представляется возможным использовать для получения 6-оксимстил-нафтойной кислоты клетки штамма Рз. рц 1 Ыа ВЬ 225, выращенные на минерально-солевой среде, со держащей другие источники углерода, нс.жели нафталин или соли салицпловой кислоты, В частности, в качестве источников углерода можно использовать углеводы (сахарозу, глюкозу, маннозу, галактозу, маль тозу, рафинозу), органические кислоты, такие как уксусная, пропионовая, масляная, янтарная, щавслсгая, пировиноградная, фумаровая, яблочная, бензойная пли их соли.Время ро" та культуры штамма Рв, 25 рц 1 Ыа В 225 ц случае использования одного из вышеперечисленных источников углерода составляет 6 - 7 ч, что значительно меньше по сразнению со временем, необходимым для роста клеток известного штамзо ма Рз. рц 1 Ыа 7 на минерально-солевой сре 3де с нафталином (40 ч) или салицилатом (72 ч). Кроме того, продолжительность процесса окисления 2,6-диметилнафталина с целью получения б-оксиметил-нафтойной кислоты при использовании клеток штамма Рь, рцсЫа составляет 12 - 15 ч, тогда как в аналогичных опытах со штаммом Рз. рц 1 Ыа 7 процесс Окисления продолжается 60 ч.Характеристика штамма Рвецс)огпопав рц 1 Ыа В 5 225,Штамм несет мутантную плазмиду ХР 1.-1, контролирующую конститутивный синтез ферментов окисления нафталина до салициловой кислоты.Морфологические и культуральные признаки. Клетки прямые палочковидные (2 - 6 Х 0,5 - 0,7 мкм), подвижные перетрихц, грам-отрццательцые, цссп;рсцосцс,Мясо-пецтанцый агар (МПА). Колонии бесцветные, гладкие,Мясо-пептанцый бульон, Растет сплошной пленкой, продуцируя при этом зеленый флуоресцирующий пигмент.Стандартная среда Кинг. Образует такуке флуоресцирующий пигмент.Физиологические признаки, Аэроб, дает положительную оксидазную реакцию и не накапливает в клетках поли-Р-оксимасляцую кислоту, Растет в интервале температур 4 - 37 С. Оптима;сьцая температура для роста 28 - 30 С.Использует углеводы, сахарозу, глюкозу, маццозу, галактозу, мальтозу, рафиноИз органических кислот использует уксусную, п 1)оп 550 цОВ)50, мас.5 пуО, цавелсвую янтарную, пировицоградцую, фумаровую, яблочную, бензойную. п-о 5 сисибснзойну 5 О, протокатеховую. Не использует салициловую.Растет на минеральной среде с нафталином в качестве единственного источника углерода. Ассимилирует ццтратцый и аммоийцый азот,желатин це разжижает.Крахмал не гидролизует,Мезоинозит не ассимилирует.Использует глицин, бецзцламиц и гиппурат.Пример. Культуру Рв, рц(с(а ВЬ 225 поддерживают на косяках с МПА, выращивают 20 ч ца среде МПА и 5 мл суспецзки клеток (109 клеток/мл) выросшей культуры высевают в медицинские колбы на 750 мл с жидкой с 1 е:ОЙ, раз.сЙ цо 100 мл.700540 4 СОстав среды, с, 0,41,00,10,0050,0010,0010,00020,2Остальное МН 4 ХО,К)НРО,КНРО 4МдЬО, Н,Оге )04 НОСаС 1, 6 Н,ОСц 5045 НОНатрий янтарнокислыйДистиллированная вода О Формула изобретечия Способ получения 5-Оксиметил-нафтойной кислоты путем окисления 2,6-диме тилцафталина с помощью микроорганизмоввида Рвецс 1 оп 1 опаз рц 1 с 1 а, вырацссццых на минерально-солевой среде, О г лч а ю щ ц Й- с я тем, что, с целью уцроцсц 5 я процесса, из вида Рзсцс 1 огпопаз рцЫа сцользунт 50 цпамм Рзецс 1 огпопаз рц(с 1 а ВЬ 225. Источники информации,принятые вс внимание при экспертизе55 1. Авторское свидетельство СССР ,"что 463702, кл, С 12 В 13/00, 193,Культуру выращивают на круговой качалке (180 об,мнц.) цри 30 С.5 Спустя 6 ч инкубации культура достигаст стационарной фазы роста, после чего в культуральцую жидкость добавляют 2,6-диметилнафталин из расчета 100 мг (0,64 ммоля) ца 100 мл среды.О Реакцию Окисления 2,-д м сс ;с 1 н- лица проводят в колбе ца качалке прц 30 С, Через 12 ч опыт заканчивают, Бактериальные клетки отделяют це 55 трифугировакием. Надосадочную жидкость упаривают )5 досуха на роторном испарителе. Сухой остаток экстрагируют эталоном и проводят препаративное выделение конечного продукта трансформации путем тонкослойцой хроматографии ца пластинках С 5 луфол УФЗз в системе бензол: метанол:ледяная уксусная кислота (45: 4: 2).В качестве эспоирующего а с 5 та применяют этанол. ЗлОат упаривают досу:са и высушивают под вакуумом. Концентрацию 55 конечного продукта определяют спектрофотометрически с использованием стандартных кривых. Выход 6-оксимстил-цафтойцой кислоты составляет 61 мг (0.3 ммоля),4Зак 7 С:)О Тира)к о 50 1 О Поиск: ) Государственного комитета СССР по делам изобретени н открыта3%5, .Чссква Ж-З 5, Рашскаи наб, д. 4/5