Способ определения эндотоксина бактерий в биологических жидкостях

(23) Приоритет -1 оаудвратвеивьй вивт СССР во делам изооретеиий и открытий(53) УЛК 576 8 .097.29(088.8 Опубликовано5.04.79. Бюллетень14 Дата опубликования описания 16, О У7 ) Заявите 54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОТОКСИНА БАКТЕ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХИзобретение относится к области медицины и биологии.Известен способ определения эндотоксина бактерий в биологических жидкостяхпутем воздействия биологической жидкостью5на клетки макроорганизма с последующимопределением количества измеьенных клеток 11.Однако известный способ сложен, длителен (исследование занимает около питисуток) и не обеспечивает высокой чувст- щвительности,Целью изобретения является повышениечувствительности, ускорения и упрощениеспособа,Для этого по предлагаемому способу биологическую жидкость вводят внутренно вмакроорганизм, отделяют перитонеальнутофткань, готовят монослойную культуру перито.иеальных клеток, прижизненно окрашиваклфлуорохромом, ощмйелттют количество клеток с окрашенными лизосомами и по величинелизосомного показателя определяют Йа-личие эндотоксина.Способ осуществляют следующим образом. Взрослым, практически здоровым, белым мышам весом 20-25 г в хвостовую вену вводят 0,2 мл испытываемой биологической жидкости. Через 60 мин животных забивают путем пережатия области шеи.Стерильно вскрывают брюшную полость и вливают туда 10 мл стерильного физиологического раствора Хенкса. В счетной камере подсчитывают количество клеток н доводят их концентрацию до 10 ф клеток/мл. Клеточную взвесь заливают в плексигласовые коробочки (прямоугольные контейнеры с крышками), на дне которых уложены предметные стекла, выдерживают при 37 С в течение 60 мин, После этого препараты споласкива ют физиологическим раствором, смывая неприкрепившиеся клетки. Эти препараты на стеклах погружают в раствор краси. теля - акридиноваго оранжевого (1 250000,4 мкгмл) в растворе Хенкса и инкубируют 60 мин при 37 С, По окончании флуорохромирования препараты отмывают от непоглощенного красителя, накрывают. покровным стеклом и окантовывают их по краям расплавленным парафином для пре. дохранения от высыхания.657062 Формула изобретения Составитель С. МалютинаТекред О. Луговая Корректор М. Ряшко Тираж 575 Подписное Редактор В. ТрубчелкоЗаказ 733/28 0 НИИПИ Государственного коиитета СССР по делам изобретений и открытий.13035, Москва, Ж.35, Раушская наб: д, 4/Ь Филиал ППП Патент, г. Угкгород, ул. Проектная, 4Готовые препараты просматривают с помощью флуоросцентного микроскопа МЛА с бинокулярной насадкой в отраженном свете при увеличении. Количественный учет кле. точной реакции на. токсическое воздействие осуществляют путем подсчета в препаратах не менее 100 клеток в разных полях зрения, Из этого количества определяют процент.клеток, в цитоплазме которых выявлялись четко выраженные лизосомы - яркокрасные образования на бледнозеленом фоне цито плазмы. Подсчет производят в трех-четырех параллельно приготовленных препаратах Данные испытания способа показали, что у здоровых животных в конгрольных проба:., где вместо эндотоксина был введен такой же объем (0.2 мл стерильного физиоло. гического раствора бенкса, количество кле. ток с выявляемыми лизосомами не превышало 20-25%. Нахождение таких клеток до 25/о относится к норме. При наличии в исследуемоп жидкости эндотоксина и при введении его животному в количестве 10 мкг, в том же объеме яидкости, содержание клеток с лизосомами, окрашенными акридиновым оранжевьм, превышает 50 - - 55/ а при введении 5 мкг эндетоксина на мышь лизосомный показатель превышает 30 - 35%.Установление лизосомного показателя выше 30%, после внутривенного введения мь 1- шам испытуемой пробы с подозрением на эндотоксип, считается положительным, т.е. говорит о наличии эндотоксина.Предлагаемый способ обладает высокои чувствительностью, сокращает время определения вместо 5 дней до 3,5 - 4 ч и не требует сложного оборудования и наличия специальной лаборатории клеточных культур. ЯСпособ определения эндотоксина бактерий в биологических жидкостях путем воздействия биологической жидкостью на клетки макроорганизма с последующим определением количества измененных клеток, отлиц наюи 4 ийся тем, что, с целью повышениячувствительности, ускорения и упрощения способа, биологическую жидкость вводят в, макроорганизм, отделяют первтонеальную .ткань, готовят монослойную культуру перитонеальных клеток, прижизненно окрашива-ф ют флуорохромом, затем определяют коли-чество клеток с окрашенными лизосомами и по величине лизосомного показателя определяют наличие эндотоксина. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Лр 1 адьева Г. Е, Действие бактериальньх токсинов на клетки организма и некоторые механизмы их детоксикацииъ.Лвторефе рат диссертации, Л 1963.