Способ идентификации микроорганизмов

АВТОРСКОМУ СВИДЕТБ 1 ЬСТВУ 6) ное к авт, св 51 л-ву -с пол и;гт 4.06.77 (21) 2498970:28-13 аязлспо соел:1;гением заявкГ 1 риоритет -Госуд ННЫК КОЫИТЕТСР 2 ДК 576.8.0 э:5.(088.( по делам изобретений и открытий., С, Антонов А. А, Белоусова и Т. П, Турова Трудового Красного м. М. В. Ломоносов Заявитель г 1 осковский ордена Ленина и орден Зна,;ени государственный университет И(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИК МИКРООРГАНИЗМОВ Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано припроведении массовых эпидемиологическихисследований, при ликвидации очагов инфекционных заболеваний, при разработке 5эффективных поливакцин, а также в различных областях микробиологической промышленности,Известен способ идентификации микроорганизмов путем их культивирования, от Оделения выросших клеток с последуюшимих лнзпсом, вылеления из лпзата ДНК,очистки, гибргидизации полученной ДНК сДНК реперного штамма и учета процентагомо;ог 1 вй в нуклеотидной последовательности.Однако известный способ является трудоемким н длительным (50 - 60 ч).Цель изобретения - ускорить и упростить способ. 20Эта цель достигается тем, что лизисклеток проводят при 37 - 50 С в течение30 - 60 41 гин, ДНК из лизата выделяют 1,5 -2,5-кратным объемом этилового спирта,очистку проводят 0,54 - 0,6%-ным объемом 25изопропилового спирта, а гибридизациюведут в течение 8 - 10 ч.П р и м е р 1. Суспензию бактериальныхклеток Е. со 1 ВЗТ, полученную в жидкойглюкозо-минеральной среде, содержашей З 0 6 г Ма,НР 04, 3 г КН,РО 4, 3 г Х 1-14 С 1, 1 л.г 1 М раствора .ЧЯ 504, 4 г глюкозы, .11 г тимилина и ло 1 л Н,О, фиксир ют после осаждения клеток 2 - 3 объемами 96%-ного этилового спирта, затем суспензиго цснтрифугируют в течение 10 агин при 3000 5000 обагин и из осадка отбирают навсску 1 г сырой биомассы, Клетки рссуспснлир ют в 50 л.г солевого раствора (0,3 М МаС 1, 0,03.гЧ цитрата натрия), центрифугируют повторно 10 лин прп 3000 - -5000 об 1 лин и осадок ресуспенлируют в 20 л.г буфера, солержащего 0,15 М ХаС 11-0,1 М ЗДТА+0,015 М цитрата натрия +0,1 М триса, рН 8,0 и лизируют добавлением 1 л.г 20% -ного раствора лолецилсульфата натрия в присутствии 100 лнг/.51.1 нроназы в течение 30 мин при 37 С. После завершения лпзпса и просветления лизата добавляют аС ло конечной концентрации 2 М и осаждают ДНК из лизата 2 объсмамн этилового спирта. Выпавший осадок ДНК переносят в 10 лл 1 М ацетата натрия рН 7,0 и после растворения ДНК осаждают 15,54% - вы м объемом и зон роп илового сп и рта по отношеншо и исходному раствору 10 лл). Выпавший мелузообразный осалок переносят в 10 л г солевого раствора (0,015 М ЯаС+0,0015 М цитрата натрия). После растворения ДНК денатурируют, лобавляя в Оаствор по каплям 10 М КаОН до рН 12,0 и прогревая в течение ЗО лик гри 60 С, нейтрализуют 0,1 н. НС 1 и доводят концентрацию солей в растворе до 0,9 М ХаС+0,09 М цптоата натрия. После этого раствор денатурированной ДНК пропускают через мембранные фильтры, промывают каждый фильтр 10 лл раствора О,З Л 4 ХаС+0,03 М цитрата натрия и высушивают при 60 С в течение 2 ч. ДНК, выделенной из 1 г бактериальной массы, достаточно для нанесения на 10 фильтров. После нанесения фильтры помещают в тефлоновые или стеклянные биксы, содер;как:е 2 ял раствора 0,3 М КаС+0,03 М цитрата натрия и меченые С 4-тимидином фрагменты ДНК Е. со ВЗТ в соотношении 1: 100 к количеству немеченной ДНК, и смесь инкубируют при 60 С в течение 8 ч. Затем определяют радиоактивность с помощью изотопного счетчика Магс, Количество реассоциированной Д 1-1 К (в процентах) подсчитывают как количество импульсов связавшейся ДНК и эту цифру принимают за 100% в гомологичной реакции (ДНК Е. со 1 ВЗТХДНК Е. со 1 ВЗТ), Процент гомологий рассчитывают как количество импульсов связавшейся ДНК (в процентах) в гетерологичной реакции, например ДНК Е, со 1 761 ХДНК Е. со 11 ВЗТ (реперный штамм) имеет 89% гомологии,П р и м е р 2. Спиртовую суспензию бактериальных клеток Е. со 11 ВЗТ, соответствующую 1 г сырой биомассы, фильтруют через мембранный фильтр диаметром 10 сл с размером пор 0,23 - 0,45 я,цк в течение 2 - 3 лия под вакуумом, фильтр переносят .-. 100 лл солевого раствора (0,15 М ХаС 1+ +С 01 Л 41 ЭДТА, рН 7), встряхивают 1 - 2 лпсн и повторно фильтруют суспензпю чсрез новый фильтр, затем ресуспендируют в 10 ил солевого раствора, содерхкашсго 0,15 Л 1 КаС 1+ 0,1 М ЭДТА, рг 1 7,0 - 8,0, К с, спензпп добавляют 10 лл 1 н. ХаОН и вы дерхкивают при 370"С в течение 1 ч. К шелочному лизату добавляют 1 каплю универсального индикатора и нейтрализуют смесь последовательным прилпванисм 5 ил 1,5 н.1;С), 5 л 1 М трис-НС буфера рН 7,4 - 1 о (,8 с 0,05 М ЭДТА и по каплям 2 лл 1,5 н,НС до рН 7,0 - 7,5. После этого к лизату добавляют 50 икг/лл панкреатической рибонуклеазы, инкубируют 30 лпн прп 37 С, затем вносят 100 лкг/лл проназы 11 ипкубзцию продолжают в течение 1 ч. Вязкий лизат пропускают 3 - 5 раз через шприц на 50 - 100 ил и наносят на мембранные фрильтры. Дальнейшие операции после нанес"ния на фильтры проводят, как в примере 1.Предлагаемый способ прост, так как внем Отсутствуют трудоемкие Операции, сокращает время до 11 - 13 ч и обеспечивает высокую точность. Способ идентификации микроорганизмовмов путем их культивирования, отделения выросших клеток с последующим их лизисом, выделения из лизата ДН 1(, очистки, гибридизации полученной ДНК с ДНК реперного штамма и учета процента гомологий в нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, лизпс клеток 35 проводят при температуре 37 - 50 С в течение 30 - 60 л.ин, ДНК из лизата выделяют 1,5 - 2,5-кратным объемом этилового спирта, очистку проводят обработкой 0,54 - 0,6%-ным обьемом изопропилового спирта, 40 а гибридизацию ведут в течение 8 - 10 ч.