Способ получения инсулина

(11) б 2 б 779 Союз Советскик Социаиистичесиии Ржпублик(23) Приорите осударствеиныи комитетовета Министров СССРио депам изобретенийи открытий) Опубликовано 0510 5) Дата опубликования описания 140878.И.Каратеева, Н.Г.Нестерова Ф.Архипова, Л.В.Васильева и 2) Авторы изобретения П.М.Ко .М.Ден А,Донецкий,Г.Горшков, М ин в Всесоюзный научна-исследовательский инстит кровезаменителей и гормональных препаратов ехнологии 1) Заявител(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИ ОдначиваетсталличЦельтоты илина.Этадение бле перв й способтоты и влина.я - повышталличес о известныысокой чаского инсуизобретениыхода крис не обеспеыхода криние чисго инсуается тем, что оса -месей проводят пос-ания хлористым натнсулина-сырца приературе 3-5 С, аморают при концентрации ель дослковых го выса рием из растворарН =2,8-3 2 и те фный инсулин осажд Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности в частности к получению медицинских препаратов, применяемых в медицинской практике при лечении сахарного диабета.Известен способ получения инсулина путе экстрации поджелудочной железы подкисленным водным эталоном, осаждением белковых примесейвакуумдистилляцией экстрактов двоййым высаливанием инсулина хлористым натрием,отделением белковых примесей при повышении рН раствора до 7,0, изоэлектрическим осаждением и перекристаллизацией це 1 левого. продукта из цитратного буфераВыход кристаллического инсулина - 2700 ел/кг, активность - 24 ед/мг 1 Ц,ацетата цинка 0,35-0,5 М на грамм инсулина при рН = 5,2-5,4П р и м е р 1. 1 кг измельченнойподжелудочной железы крупного рогатого скота экстрагируют 3,5 л 82 - ногооэтилового спирта при рН = 2,8-3,2 итемпературе 16 С в течение 3 часов.3 кстракт отделяют центрифугированием,а остаток повторно экстрагируют 1,1 л65 - ного этилового спирта при рН=2,8-3,2 в течение двух часов, В экстракте 20-ным растворомКаОН устанавливают рН = 3,5 и к нему добавляют 20 ный водный растворСДСГ(15 мл на 1 лэкстракта) .Через 10-15 минут устанавливают рН = 4,3-4,5 и после сепарирования экстракта упаривают на вакуум ввыпарной установке при рН = 3,5, Водный раствор обезжиривают и высаливают инсулин 28-ным водным растворомКэС 0. Получают 1 г инсулина-сырца.1 г инсулина-сырца растворяют в100 мл дистиллированной воды, корректируют рН раствора до 3,05, и раствор выцерживают при температуре+5 С вгтечение 12 часов, Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера с добавлением в раствор 10 г кизельгура. В полученном фильтрате устанавливают рН=5,3 и к нему добавляют 3 мл3б 10-ного раствора ацетата цинка, Раствор выдерживают при температуре 5 С в течение 24 часов, выпавший осадок ,отделяют центрифугированием, растворяют в 40 мл дистиллированной воды, содержащей 520 мг лимонной кислоты, Затем в раствор добавляют 7,2 мл ацетона, 072 мл 5-ного раствора ацета та цинка и 0,024 мл фенола. Раствор охлаждают доФ 1 С,корректируют рН 12,5-ным аммиаком до рН8,0-8,5. При перемешивании раствора через 3 м.нуты корректируют рН до бр О-б, 2, и раствор при температуреФЙ выдерживают в тсчение 2-х часов и затем при ком" ватной температуре в течение 24 часов.Выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, а затем высушивают и ваку" уме при 20 С до постоянного веса. Выход инсулина - 3220 ЕД/кг поджелудочной железы, активность -25,5 ЕД/мг.П р и м е р 2. Зкстракцию и обра" ботку экстракта до стадии получения инсулина-сырца после первого высаливания производят, как описано в примере 1.1 г инсулина-сырца растворяют в 100 мл дистиллированной воды, выдер" живают при комнатной температуре и перемешивании в течение 2-х часов и затем 10 часов при температуре+ЗОС. Выпавший осадок отфильтровывают, а в фильтрате при перемешивании устанавливают рН:5,0, добавляют к раствору 1,5 мл 10-ного раствора ацетата цин,ка, и раствор выдерживают в течение 24 чабов, Выпавший осадок аморфного инсулина отделяют центрифугированием, растворяют в 50 мл дистиллированной воды, содержащей 650 мг лимонной кислоты, в раствор добавляют 9 мл ацетона, 0,9 мл 5-ного раствора ацетата, цинка и 0,03 мл,фенола.Раствор охлаждают до температуры +1 - 3 С, устанавливают 12,5-нымОаммиаком рН = 8,0-8,5 и через три минуты при перемешивании понижают10-ной соляной кислотой до рН=б,2 через 20 часов до рН 5,8. Растворвыдерживают при этой температуре, и 2 б 779выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают ацетоном и высушивают в вакууме при комнатной температуре до постоянного веса.Выход инсулина - 3000 ЕД/кг поджелудочной железы, активность -24,5 Ед/мг.Предлагаемый способ получения инсулина позволяет по сравнению с иэ" вестным упростить стадию химической очистки инсулина, полученного после первого высаливания (до 2-х операций) Ю более качественно и без потерь инсулина отделить белковые примеси из раствора, количественно выделить инсулин при изоэлектрическом осаждении и кристаллизации, сократить техноло" 15 гический процесс на 120 часов ( врасчете на 1 миллион единиц инсулина), повысить выход инсулина с 2700 до 3200 ЕД/кг поджелудочной желе.-ы, а также его чистоту (снижение интен сивности полос белковых примесей наЪэлектрофореграммах злектрофореза в полиакриламидном геле. Формула изобретения25Способ получения инсулина путемэкстракции поджелудочной железы подкисленным водным этанолом осаждениембелковых примесей, вакуумдистилляцией экстрактов, двойным высаливанием 30 инсулина хлористым натрием; отделениембелковых примесей при повышении рНраствора до 7,0 изоэлектрическим осаждением аморфного инсулина и перекристаллиэацией целевого продукта из цит ратного буФера, о т л и ч а ю щ и й-.с я тем, что, с целью повышения чис-тоты и выхода кристаллического инсулина, осаждение белковых примесей проводят после первого высаливания,хло ристым натрием из раствора инсулинасырца при рН = 2,8-3,2 и температуре3-5 ОС, аморфный инсулин осаждают приконцентрации ацетата цинка 0,35-0,5 Мна грамм инсулина при рН= 5,2-5,4.45 Источники информации, принятые всвнимание при экспертизе:1, Авторское свидетельство СССРР 332832, кл. А 61 К 17/00, 1972,Составитель С.МалютинаТехред Е. Давидович Корректор И. Гоксич Редактор Ж.Рожкова Заказ А Аещеи Филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 е5513/9 Тираж 703 Подписное ПНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва ЖРаушская наб. д, 4/5