Способ определения гистамина

1 ЮФЮ 3 Чп 11 8619 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Свое Советских Социалистических Республик(51) М, Кл,- 6013 Ч 33/1 Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретенийи открытий 3) Приоритет 43) Опубли 53) УДК 615,476(088.8) овано 30.10,77, Бюллетень"бликования описания 03.11.77.-И. Птитут эстерств ССРинституи гиги учно-исследовательский инс линической медицины МиниЛитовской Научно-исследовательскиймикробиологии спериментальиои здравоохранения т эпидемиологиины 4) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТАМИНА ляется трудоне обеспечиваения рови 15Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в медицине для диагностики гиперчувствительности немедленного и замедленного типа, а также оценки эффективности лечения.Известен способ определения гистамина в различных фракциях крови путем ее экстракции, перевода в водную фазу, конденсации с о-фталевым альдегидом и спектрофлуориметрирования.Однако известный способ явемким, малоинформативным иет стабильности результатов.С целью упрощения способа и увелич стабильности результатов гистамин из к экстрагируют гептиловым спиртом.Способ осуществляется следующим образом.В центрифужную силиконированную пробирку с 0,5 мл 3%-ного раствора триолона берут из локтевой вены 5 мл крови, осторожно перемешивают и наслаивают на поверхность смеси уротраста и фикола (10 частей 40% -ного раствора уротраста с конечной плотностью 1200 г/мл и 24 части 9%-ного раствора фикола, полимера с молекулярным весом около 400000; конечная плотность смеси 1073 г/мл) в другой силиконированной пробирке. После оседания эритроцитов плазменный слой разделяется на две части: верхний широкий слой плазмы с взвешенными лимфоцитами, моноцитамп, базофилами и тромбоцитами и нижний узкий слой с гранулоцитами и эозинофилами. Лимфоцптарную и гранулоцитарную фракции отсасывают силиконированной пипеткой в отдельные центрифужные пробирки. Для подсчета лейкоцитов как лимфоцитарной, так и гранулоцитарной фракций из обеих пробирок в отдельные лейкоцитарные меланжеры набирают плазму с лейкоцитами до метки 0,5 и 0,05%-ный раствор метиленовой сини в 0,5%-ном растворе уксусной кислоты до метки 11. Обе пробирки центрифугируют при 1600 д и 0 - 5 С в течение 20 мин. Надосадочную плазму верхнего лимфоцитарного слоя сливают в другую пробирку для определения количества свободного гистамина в плазме, а надосадочный слой гранулоцитарной фракции крови с примесью фикола и уротраста выбрасывают. Получают две пробирки с осадками лейкоцитов: смесь лимфоцитов, моноцитов и базофплов (выход около 90% ), смесь гранулоцптов с эозинофилами (выход около 50%). Обе пробирки с осадками лейкоцитов, а также плазму без форменных элементов с осадками лейкоцитов и плазму без форменных элементов быстро охлаждают до температуры минусЗаказ 2417/10 Изд.877 Тираж 1109 Подписное НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 340 С и в таком виде оставляют в холодной камере на 1 - 6 суток. При продолжении анализа пробирки оттаивают. Процедуру замораживания и оттаивания повторяют еще раз, после чего к 2 мл плазмы или к осадкам лейкоцитов добавляют бидистиллированную воду до 4 мл, тщательно перемешивают и прибавляют 0,5 мл 5 н. едкого натрия, Смесь насыщают хлористым натрием и добавляют 10 мл гептилового спирта. После перемешивания на качалке в течение 30 мин пробирки центрифугируют при 1600 д в течение 10 мин, 8 мл органической фазы переносят в другую пробирку с 3 мл 0,1 н, соляной кислоты, встряхивают в течение 20 мин и центрифугируют при 36 д в течение 10 мин.1 2 мл водной фазы с гистамином добавляют 0,4 мл 1 н. едкого натрия, содержимое пробирки тщательно встряхивают и добавляют 0,1 мл свежеприготовленного 1 о/о-ного раствора о-фталевого альдегида в абсолютном метиловом спирте. После тщательного перемешивания выжидают в течение 4 мин. Затем добавляют 0,2 мл 3 н. раствора соляной кислоты.Флуориметрирование проводят при максимуме спектра возбуждения 360 нм и сканировании спектра флуоресценции (максимум при 450 нм). При работе с флуоресцентным спектрофотометром Н 11 асЫ МРГ - 2 А используются щели прибора величиной соответственно 10 и 20 нм, чувствительность 2, дополнительное шунтирование фильтром УИ - 39. Одновременно анализу подвергают 4 мл бидистиллированной воды и два образца с 0,5 мкг гистамина в 0,1 н. растворе соляной кислоты. Однако в одном из них при реакции конденсации меняют очередность добавления 3 н. соляной кислоты и о-фталевого альдегида, так как в кислой среде реакция конденсации гистамина с о-фталевым альдегидом не происходит. Неспецифическую флуоресценцию реактивов вычитают. В наших условиях она не превышает интенсивности свечения 0,01 мкг гистамина с о-фталевым альдегидом в кювете,Подсчет количества лейкоцитов в лимфоцитарном и гранулоцитарном слоях венозной крови, с учетом гемограммы и числа лейкоцитов капиллярной крови, позволяет полученный результат перевести на концентрацию резервного гистамина в мкг/10 лейкоцитов лимфоцитарной или гранулоцитарной фракции венозной крови, а также концентрацию гистамина в отдельных фракциях капиллярной крови.Предлагаемый способ определения гистамина повышает точность и надежность результатов, уменьшает возможность ошибок при экстрагировании вещества, упрощает процедуру исследования, требует меньших затрат труда и лабораторного оборудования, дает 25 возможность судить о содержании свободного и резервного гистамина в отдельных фракциях венозной и капиллярной крови. Способ определения гистамина в различных фракциях крови путем ее экстракции, перевода в водную фазу, конденсации с о-фталевым альдегидом и спектрофлуориметриро вания, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения способа и увеличения стабильности результатов, гистамин из крови экстрагируют гептиловым спиртом,