Способ получения олигорибонуклеотидов

(и) 4585 И блы на,еИЗОБРЕТЕИ ИЯ Союз Советских СоциалистическихРесптблик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1) Зависимое от авт. свидетельства 51) М, Кл. С 07 с 1 51,50 73 (21) 1926849,23 22) Заявлен ем заявкиприсоеди Государственный комитет Совета Министров СССР ло делам изобретенийи открытии 2) Приорит Опубликовано 30,01.75. БюллетеньДата опубликования описания 18.03,75 УДК 547.963.3(088.8) вторыобретени Т. А. Авдонина, Л. Л. Киселев и Н, В. ГнучевИнститут молекулярной биологии АН СССР(54) СПОСОБ ПОЛ усовершенствова- рибонуклеотидов Способосмесь дкоторая мдивидуалПри не использоваться олигорибонукл ф) яХф где п)3 У), цитидин (Ц).0 Выход продуктов полностью зависит отприроды полирибонуклеотида, подвергаемого ферментативному гидролизу (содержания в нем последовательностей ГфГфАф, ГфГфЦф, ГфГфУф) и составляет 80/о от теоретически 5 возможного.Если гидролизу подвергается сополимерполи-(У, Г) или поли-(А, Г) или поли-(Ц, Г), то во фракции тринуклеотидов будут сразу индивидуальные ГГУ, ГГА и 1 ГЦ, соответ ственно, т. е. отпадает необходимость во втором разделении.П р и м е р. 2 мг РНК вируса табачной мозаики выдерживают при 37 С в течение 4 час с 1,3 мл 3,257,-ного раствора кетоксаля, 25 0,05 мл раствора какодилата натрия(159,98 г/л) при рН 7, 0,125 мл раствора этилендиаминтетраацетата натрия (37,24 г/л) .После окончания реакции РНК освобож от избытка кетоксаля трехкратным осажд 30 ем из 70-ного спирта. лучать ГфАф, на инасщепление РНК с помощью гуам инозина и 2 зина после предодных гуанозина на с глиоксалем.тринуклеотидов ф а также этих дуальном состояедварительно обСпособ основывается на устойчивости фосфодиэфирной связи между туаниновыми основаниями, модифицированными кетоксалем, и соседним с 3 стороны нуклеотидом при гидролизе с помощью рибонуклеазы Т, В результате при действии на любые модифицированные полирибонуклеотиды рибонуклеазой Т, образуется фракция тринуклеотидов, которая содержит только смесь ГфГфАф, ГфГфЦф и ГфГфУф. Дальнейшая обработка состоит в снятии модификатора, что достигается простым изменением рН раствора и, в случае необходимостиразделением смеси трех тринуклеотидов хром атографическим методом на,индивидуальные тринуклеотиды. дают ениИзобретение относится к нию способа получения олиг заданного строения.Известно специфическое р (рибонуклеиновой кислоты) анил-РНК-азы Т, по остатк экзо-К,К-диметиламиногуано варительной реакции произв (Г) и 2-экзоч-метилгуанозиС целью получения смеси ГфГфАф, ГфГфЦф, ГфГфУ же тринуклеотидов в индиви нии, полирибонуклеотид пр рабатывают кетоксалем. позволяет одновременно пинуклеотидов ГфУф, ГфЦф,ожет быть легко разделенаьные динуклеотиды.обходимости способ можетдля получения более длинныхеотидов общей формулы (Г458555 Предмет изобретения Составитель Е. Соколова Техред О. Гуменюк Редактор Е. Дайч Корректор О. Тюрина Заказ 562/10 Изд.1078 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 Осадок растворяют в 2,5 мл воды, доводят рН раствора уксусной кислотой до 4,5 и добавляют 0,1,мл раствора рибонуклеазы Т содержащего 500 единиц активности фермента и выдерживают 2 час при 37 С. Затем раствор наносят на колонку, объемом 2,5 мл, заполненную смолой ДЭАЭ - сефадекс А - 25,Смола в колонке уравновешена буфером А, содержащим, г/л: 2,42 оксиметиламинометана-трис, 1,23 борной кислоть 1, 420 мочевины, рН 7,6.К колонке подключают раствор из двух последовательно соединенных сосудов, в первом сосуде - буферный раствор А, во втором - буферный раствор Б, содержащий, т/л: 2,42 оксиметиламинометана, 1,23 борной кислоты, 420 мочевины, 15,55 хлористого натрия, рН 7,5.Скорость протока жидкости через колонку 3 мл/час. С 27 по 33 мл собирают раствор с колонки, содержащий смесь Аф, Цф, Уф и Гфф (Г фф - продукт реакции Гф с кетоксалем), С 66 по 90 мл собирают раствор с колонки, содержащий ГфАф, Уф и ГфЦф,С 105 по 120 мл собирают раствор, содержащий ГфГфЦф, ГфГфАф и ГфГфУф.Выход динуклеотидов 0,4 мг, тринуклеотидов 0,15 мг.В случае необходимости из собранных растворов можно удалить соль пропусканием ихчерез колонку со смолой биогель - Р, иличерез колонку со смолой ДЭАЭ - целлюлозой.10 15 Способ получения олигорибонуклеотидовобщей формулы (Гф)Хф, где и) 1, Х аденозин (А), уридин (У), цитидин (Ц), обработкой полинуклеотидов рибонуклеазой Т, и последующим разделением по длине цепи из вестными приемами, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения процесса, полирибонуклеотид предварительно обрабатывают кетоксалем,