Способ получения меченных тритием нуклеозидтрифосфатов

юО П И С А Н И Е и)412764ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистицеских Республик(51 С 07 Н 19/00 исоединением заявкиГасударственный комитет Совета Министров СССР па делам изабретений и аткрытий(71) Заявител 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ НУКЛЕОЗИДТРИФОСфАТОВ ный способ получения ме рифэсфатэв позволяет по родукт только низкой уде неравномерно распределе днако извест ных нуклеэзидтчать целевой пй активности сй меткой. способ получения меченеозидтрифосфатов отличаго тем, что соответствуюенный нуклеозидмонофосфа на палладиевом катализа- обработке газообразным едлагаемыи ных тритием нуклтся от известно щий галоидзамещ абсорбированный торе, подвергают Изобретение относится к способу получения, меченных тритием биологических соединений которые могут найти применение в биологических и биохимических исследованиях.Известен способ получения меченных С нуклеозидтрифосфатов, заключающийся в том что выращивают культур микроорганизмов на среде, содержащей С О, выделяют из,фбиомассы меченую РНК, гидролизуют ее до нуклеотидов, разделяют их с последующим биохимическим фосфорилированием отдельных нуклеотидов до нуклеозидтрифосфатритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченного тритием нуклеозидмонофосфата и последующим биохимическим фосфорилированием выделенного нуклеозидмонофосфата до нуклеозидтрифосфата и радиохимической очисткой последнего, совмещенной с процессом фосфорилирования и выделением целевого продукта известным способом,Обычно меченные тритием нуклеозидмо -нофосфаты отделяют от соответствующих галоидзамещенных и продуктов радиолиза на смоле Дауэкс 1 х 8 в формиатной форме.При этом для элюции аденозинмонофосфата, цитидинмонофосфата и уридинмонофосфата испэльзуютсээтветственнэ 0,1; 0,2 и 2,0 н, муравьиную кислэту.После этого выделенные нуклеотиды концентрируют, например, с помощью активиро - О ванного угля и затем фосфорилируют до трифосфатов ферментной системой, выделенной из бактерий БвсЪемсЪа соС . Продукты фосфорилирования обычно разделяют на ионообменной ДЭАЭ-целлюлозе Ав би карбонатной форме с помощью линейногоЗаказ 5442/171 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская набд,4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 3градиента триэтиламмоний-бикарбонатного буфера. Выход по активности трифосфатов 50-70%. Поврежденные нуклеотиды и другие продукты радиолиза не подвергаются фосфорилированию, в связи с чем остальная радиоактивность сбрасывается при разделении продуктов фосфорилирования.Радиохимическая чистота полученных нуклеозидтрифосфатов не ниже 99%. Высокая радиохимическая чистота препаратов достигается на последней стадии, в процессах биологического фосфорилирования и выделения препарата за счет высокой специфичности ферментов к субстрату, Таким образом, стадии фосфорЮщрования и выделения конечного ц препарата совмещены с его радиохимической очисткой.Предлагаемый способ иллюстрируетсяФ"ледуюшим примером,100 мг 5-В г -цитидинмонофосфата ж (5-В -ЦМФ) наносят на 1000 мг катализатора (10% Ро на угле ф ХОИ 1 ф). Тритирование проводят в стеклянной ампуле со впаянным электродом, вокруг которого помешают нанесенный на стекловату катали- ф затор с 5-Вг -ЦМФ. Время тритирования в условиях разряда 30 мин, температура в ампуле 120-150 оС. После окончания тригпрования продукты с катализатора смывают 60 см спиртоаммиачной смеси (1 н. 0 раствор аммиака в 50 О/о-ном спирте), Сухой остаток растворяют в 20 см воды и .вносят на колонну, заполненную смолой Да уэкс 1 х 8 в формиатной форме. Колонну праМ 4с 5мывают 300 см дистиллированной воды, а затем меченный тритием ЦМФ элюируют 170 см 0,2 н. муравьиной кислоты. По лученный препарат ЦМФ-( 5 Т) концентрируют на активированном угле и фосфорилируЪют 10 см ферментного раствора до цитидинтрифосфата (ЦТФ). Продукты фосфорилирования разделяют на колонке, заполненной ДЭАЭ-целлюлозной Ав бикарбонагной форме. В качестве элюэнта используют линейный градиент концентрации триэтиламмоний-бикарбонатного буфера (0,01-0, 21 моль/л). Концентрирование ЦТФ проводят с помощью КМ-целлюлозы,Формула изобретения Способ получения меченных тритием нук- леозидгрифосфатов биохимическим фосфорилированием соответствующих меченых нуклеозидмонофосфатов с последующим выделением целевого продукта известным способом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения удельной активности и радио- химической чистоты, соответствующий галоидзамещенный нуклеозидмонофосфат, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченного тритием нуклеозидмонофосфата и последующей радиохимической очисткой последнего, совмещенной с процессом фосфорилирования.