Деления легоглобина

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советски Социалистических РеспубликК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Зависимое от аэт, свидетельстваЗаявлено 26.11.1970 ( 1408921/23-4) М. Кл. С 07 д 7/00 заявкиприсоединен ПриоритетОпубликовано 15.Ч,1972. Бюллетень1 Комитет по делам обретений и открытий ри Совете Министров СССР, Баха нститут биохимии ЕЛЕНИЯ ЛЕГОГЛОБИН СПОСОБ. Белки, содержащиеся в ивают сульфатом аммоИзобретение относится к получению гемоглобина корневых клубеньков высших растений - легоглобина. Этот гемопротеид является, вероятно, функциональным аналогом гемоглобина, Кроме того, этот белок непосредственно связан с эффективностью фиксацииазота в клубеньках бобовых растений. В видепрепарата сохраняющего свои свойства прихранении этот белок никогда не получали,Известны способы выделения легоглобина 10из клубеньков растений который заключаются в том, что клубеньки после разрушенияэкстрагируют водой или буферными растворами (при кислых значениях рН 5,6) центрифугируют и высаливают сульфатом аммония. 15Исследования проводят с растворами полученного осадка легоглобина после удалениясульфата аммония путем диализа,Однако препараты, полученные известнымспособом, окисляются природными окислителями в момент выделения, в результате чегоне сохраняют своих нативных свойств.С целью получения устройчивого препаратапредлагается применять инертный по отношению к легоглобину адсор бент полимерной 25природы - капрон. Клубеньки срезают с участком корня, затем разрушают их (получаютгомогенат) в присутствии порошка капрона.Полученную массу помещают в буферный раствор,рН 7,0 для экстракции легоглобина, За тем центрифугируютцентр ифугате, высалния.Легоглобин, осажденный сульфатом аммония, очищают фракционированием на колонке, заполненной био-гелем Р, уравновешенным 0,01 М Трис-НС 1 буфером с рН 7,0.Прп этом легоглобин очищается от нпзкомолекулярных примесей и негеминовых белков.После фракционирования белок лиофилизируют и получают сухие препараты легоглобина красного цвета, сохраняющие свойства исходного белка и хорошую растворимость в водных буферных растворах в широком диапазоне рН.Все операции по выделению и очистке белка проводят при рН 7,0, что очень важно, поскольку величина рН, 7, как берется в известных способах, является оптимальной для действия ,растительных фенолоксидаз и способствует окислению железа в составе гема легоглобина,П р и м е р. Способ получения препаратов легоглобина из клубеньков люпина, Клубеньки срезают с участком корня во избежание окисления легоглобина на поверхности раны. Гомогенат получают в кофейной мельнице с пластмассовым резервуаром типа КМ, Разрушают клубеньки в течение 10 - 15 сек в присутствии порошка капрона, который добав338524 Составитель А, АкимоваТехред Л. Богданова Редактор Е. Левина Корректор Т, Китаева Заказ 1692715 Изд. л 1 е 737 Тираж 448 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушскаи наб., д, 475 Типографии, пр. Сапунова, 2 ляют в количестве 25 - 80/о от веса клубеньков. Полученную массу быстро перекладывают в раствор 0,02 М Трис-НС 1 буфера с рН 7,0 для экстракции легоглобина, Через 20 мин гомогенат отжимают через полотно и экстракт центрифугируют 25 мин при 23000 д.Белки, содержащиеся в центрифугате, высаживают сульфатом аммония. При этом фракцию, полученную при насыщении сульфатом аммония от 0 до 55%, отбрасывают. Фракцию с 55 - 80% насыщения растворяют в неболь. шом количестве воды и наносят на колонку с био-гелем Р, уравновешенным 0,01 М Трис-НС 1 буфером до рН 7,0.При фракционировании на био-геле Ротделяется значительная по количеству белка фракция, не содержащая легоглобин, Легоглобин элюируют с колонки количественно в составе фракции 11 и проявляют его спектрофотометрически. Последнюю фракцию собирают, быстро замораживают и лиофилизируют.Выход легоглобина количественный, Растворы легоглобина обнаруживают полосы поглощения характерные для гемоглобинов в видимой области спектра при 412, 543, 572 ммк и слаоую полосу при 630 ммк. При переводе легоглобина в пиридингемохром в спектре обнаруживают полосы поглощения при 558 и 526 ммк. Для СО-производных наблюдают полосы поглощения при 542 и567 ммк.В препарате легоглобина найдено 0,33%5 железа и 3,8 о/о гема,Негаминовое железо не обнаружено.При пропускании через раствор легоглобина чистого кислорода, а также при стояниина воздухе легоглобин оксигенируется.10 Предлагаемый способ получения легоглобина прост и эффективен, так как позволяет получать значительное количество легоглобина,не потерявшего своих основных свойств после лиофилизации, Получение лиофилизиро 15 ванных, хорошо сохраняющихся препаратовлегоглобина позволяет проводить исследования независимо от вегетационного сезона. Предмет изобретения20Способ выделения легоглобина из клубеньков бобовых растений путем разрушения их,экстрагирования буферным раствором, центрифугирования и высаливания сульфатом ам 25 мония, отличающийся тем, что, с целью получения устойчивого препарата, разрушениеклубеньков проводят в присутствии капрона,г.олученный высаливанием целевой продукточищают на био-геле Р, и ведут процесс30 при рН 7,0,