Способ получения глюканорасщепляющихферментов

ОП И САН И ЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ 3 4357 Сова Ссеетских Социалистических РеспубликЗависимый от патента1 ПК С 12 д 13111,1968 ( 1224831/28-13) явл Приоритет ЗОЛ 1.1967,ВП 6 а/125697, Г Опубликовано 07,Х.1971, Бюллетень2 Дата опубликования описания 14.111.192 Комитет оо делаиобретений и открцтири Совете МииистооеСССР УДК 577.15,07(08 Авторыизобретент Иностранцыюллер, Барбара Херфорт,ара Хефнер и Клаус Ридельая Демократическая Республика)ностранное предприятиеди Герунгсиндустри, Энзимологи унМикробиологиая Демократическая Республика) Иоханн Хубер льга М Барб манскИ т фюр рудольф Дикшайт(Германск ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКАНОРАСЩЕПЛЯЮЩИХ ФЕРМЕНТОВбласти биотехни нор асщепляющи Изобретение относится к оческого получения глюках ферментов (энзимов).Известен способ получения глюканорасщепляющих ферментов, например глюконазы, путем выращивания их продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии минеральных солей, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости,Предлагаемый способ позволяет получать глюконазу, расщепляющую полисахариды с Р,3 и р,4 глюкозидными связями.Для этого в качестве продуцента используют Вас 11 цз зцЫ 118 СОН1872,Сущность способа заключается в следующем.Выращивают продуцент глюканорасщепляющих ферментов, например глюконазы, амилазы Вас 11 цз зцЫ 11 з СОН1872 на водйой минеральной среде, содержащей источники азота, углерода в течение 24 - 72 час при аэрации и перемешивании среды с последующим выделением ферментов одним из известных способов.Вышеуказанный штамп выделен из естественных материалов и адаптирован в процессе длительного культивирования и гидролпзузлаков.Штамм Вас 11 цз зцЫ 11 з имеет следующую характеристику.Морфология. Вегетативные клетки имеют форму подвижных продольных палочек с закругленныхи концами, в виде одиночных или сдвоегпЫх палочек или же коротких це 01 ек. Величина клеток 2,5 - 6,0 К 0,6 - 0,8 лк. Споры овальные, без определенной локализации в спорангпях. Спорангпи не вздутые, Повсдение по Граму положительное, в старости граьлабильное.Органические среды. На агаре мясного бульона интенсивное развитие, колонии с матовым блеском. Грязновато-белого цвета, края дольчатые, частично мицелеобразные, бахромчатые. Прокол агара богатые колонии на поверхности, а вдоль прокола - слабое развитие.На мясном бульоне интенсивное развитие в виде белых Шмер и нежной, легко рвущейся поверхностной пленки, легкое помутнение. На мясном бульоне и глюкозе интенсивное развитие как на чистом мясном бульоне, толстая прочная поверхностная пленка. На мясном бульоне с ИаС 1 - 5% ХаС 1 - интенсив314357 Корректоры: С. Сатагулова и Н, Шевченко Заказ 247/17 Тираж 473 Изд.96 Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 ное развитие. 7% ХаС - очень слабое развитие.На ломтиках или кусках картофеля - интенсивное развитие, слизистые колонии с мокрым блеском, грязновато-белого цвета до 5 желтовато-коричневого, после 3 - 4 дней при 37 С образуются пузырьки (заполненные слизью), старые колонии темно-коричневого цвета, без складчатости.Желатина. Келатину разжижает, Молоко 10 коагулирует. Казеин гидролизует. Сероводород и индол не образует. Отношение к углеводам, Усваивает глюкозу, сахарозу, маннозу, галактозу, арабинозу, мальтозу, декстрин, маннитол, крахмал. 15П р и м е р 1. Для предлагаемого способа получения глюконазы с помощью варианта Вас 111 цз зцЫ 1111 з СОН1872 употребляется следующая среда в %:дробленого ячменя 9 20 дробленых соевых бобов 3КНР 04 0,25ИазНРО 4 1,2 Н 20 12, водопроводная вода, рН до стерилизации 7,2 рН после стерилизации 6,5 - 6,9. 25Производственную среду разливают по 50 мл в устойчивую круглодонную колбу емкостью 500 мл, стерилизуют, засевают и устанавливают на качалку для встряхивания. Необходимое посевное количество составляет 30 1 - 2%. Целесообразно, чтобы плотность посевного материала составляла около 6 10 в клеток/мл. Продолжительность встряхивания составляет 3 дня, инкубационная температура 30 С. 35Во время инкубационного периода в 3 дня в производственной среде наряду со значительным количеством глюконазы, а именно 80 - 150 меж/ед/мл. образуется еще амилаза и протеаза, Количество полученной амилазы 40 составляет от 2000 до 5000 меж/ед/мл, образовавшееся количество амилазы не зависит от количества образовавшейся глюконазы.П р им ер 2. Производство глюконазы осуществляют в ферментационном баке емко стью 500 л из стали Г 2 Л. С принудительной аэрацией.Состав питательной среды следующий в %:дробленый ячмень 2картофельный крахмал 2 50 соевая мука 0,95ДННРО 4 1,5цитрат натрия и различныемикроэлементы 0,08водопроводная вода. 55После стерилизации в течение 30 мин при 120 С концентрацию Н-ионов устанавливают на рН 7,0 - 7,2.После охлаждения осуществляют посев при стерильных условиях 2% посевного мате риала. 4Лэрация во время логарифмической фазы роста составляет 0,7 л воздуха на 1 л жидкости в мин.Скорость движения мешалки составляет в зависимости от ее свойств 160 - 420 об/мин. Через 36 час ферментацию прерывают, так как питательная среда истощается углеводами и наступает изменение показателя рН. По прошествии 36 час выдерживания культуры образуются 100 - 150 меж. ед. глюконазы, 2000 - меж. ед. амилазы и около 1 единицы протеазы (по казеину).П ример 3. 1000 мл. фильтрата культуры с активностью р-глюконазы в 150,0 м.е./мл и активностью альфа-амилазы в 500 м. е./мл осветляют добавлением геля кальция, Осаждение желательного фермента производится при помешивании с твердым (ХН 4)250. Может быть использован чистый для анализа или технически чистый осадитель, Осаждение происходит при температуре от 10 С до комнатной. Осадок высушивают в вакууме при 40 С и вслед за тем гомогенизируют. Посредством кратковременной обработки влажного препарата ацетоном при 0 С период сушки препарата значительно сокращается, и достигается его осветление. Конечный продукт порошкообразен, не гигроскопичен и хорошо растворим в воде.Выход. Из 1000 мл, фильтрата культуры вышеуказанной активности получаются 10 г твердого продукта с активностью 9,0 м. е./мг р-глюконазы и 160 м. е, Е-амилазы. Это соответствует выходу, приблизительно 90% р-глюконазы и 35% 1,-амилазы.П р и м е р 4. Осаждение ферментов из 1000 мл. фильтрата культуры вышеуказанной активности осуществляют добавлением ацетона при перемешивании и температуре 0 С до степени насыщения 0,65. Показатель рН раствора культуры устанавливают фосфатным буфером по Соренсену на рН 7,0,Продукт осаждения обрабатывают согласно вышеупомянутому описанию.Выход. Получают 11,5 г твердого продукта со следующей активностью; р-глюконазы 8,0 м. е./мг=82%, 1,-амилазы 300 м. е./мг) ) )77%. Предмет изобретенияСпособ получения глюканорасщепляющих ферментов, например глюконазы, путем выращивания их продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота в присутствии минеральных солей, с последую. щим выделением фермента из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью получения глюконазы, расщепляющей полисахариды с р,3 и р,4 глюкозидными связями, в качестве продуцента используют Вас 111 цз эцЫ 111 з СОН1872,