Способ выделения олигонуклеотидов

Союз СоветскихСоциалистических ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Республик 1) Дополнительно вт. свид-ву) Заявлено 15.03,67 (21) 1225057/28 -с присоединением за Государственный кометеСовета Министров СССпо делам изобретенийи открытий(43) Опубликовано 05,12.76. Бюллетень М 45 Ь) Дата опублико ния описания 25.02.7 2) Авторы изобретени,В. Д, Аксельрод, А, А. Баев, М. А. Гайлум и И. Я. Лидака(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИ 17 или Дауэксавьиной кислото лю К растворяют в 500 мл уфера (рН - 7,0 - 7,5 ). добавляют 10 мл риорма и инкубируютв жащий уют на чале водои, рН 7,0 - 7,5) Известен спосоо выделения олигонуклеотидовиз рибонуклеазного гидролизата РНК путем егодвухступенчатого сорбирования на колонках с анионитом, элюирования на первой ступени солевымраствором, а на второй - муравьиной кислотой иформиатом аммония с последующим концентрированием одним из известных способов, напримерлиофилизацией.Цель изобретения - упростить способ, повыситьчистоту и выход олигонуклеотидов. Достигаетсяэто тем, что по предложенному способу первуюступень элюирования осуществляют при повышенной температуре, преимущественно 50 - 90 С. Сорбцию на первой ступени проводят на анионите Эктеол - целлюлозе, а на второй - на АВ - 17. Элюцию напервой ступени осуществляют ступенчато водносолевым раствором,Способ выделения олигонуклеотидов заключается в следующем,Рибонуклеазный гидролизат РНК, содерсмесь монов и олигонуклеотидов, сорбиранионите, например Эктеол-целлюлозе, и элюируютводным солевым раствором при повышенной температуре, преимущественно, 50 - 90 С.Полученные фракции вновь сорбируют на анионите, например АВ - , и э ируютолигонуклеотиды мур й и смесью еес формиатом аммония.Выделение мононуклеотидов проводят анало гично, но элюцию на второй ступени проводятодним из известных способов, например уксуснойкислотой. Полученные фракции чистых мононуклеотидов концентрируют упариванием в вакууме, аолигонуклеотидов - лиофилизацией, Готовые про дукты являются гомогенными хроматографическими веществами.Пример. 10 г РН0,02 м трис - ацетатного бК полученному раствору5 бонуклеозы, 1 мл хлорофтечение 24 часпри 37 С.По окончании гидролиза рибонуклеазу удаляютпутем обработки гидролизата КМ - целлюлозой исорбируют на колонке с Эктеол - целлюлозой 0 (0,4 - 0,7 мгэкв/г), снабженной рубашкой для обогрева,Сорбцию проводят из расчета 10 г исходнойРНК на 3,0 л анионита (во влажном виде) .Элюируют при 60 С ступенчато: вна 5 а затем раствором ацетата аммония (243623 Составитель Т. ПолянскаяТехред 3. фанта Корректор Б. Югас Редактор Н. Коган Заказ 5748/272 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д.4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Эпоследовательно концентрациями 0,04; 0,08; 0,12 и 0,17 М со скоростью 60 мл см /час. Полученные фракции моно - , ди - , тринуклеотидов вновь сорбируют на колонках с анионитом АВ - 17 (200 - 400 меш), элюируют кипяченой дистиллированной водой в количестве, равном тройному объему колонки. Мононуклеотиды элюируют ступенчато: 0,8 М уксусной кислотой - 3 - цитидиловую, 6 М уксус 1ной кислотой - 31-уридиловую кислоту,10Динуклеотиды элюируют в линейном градиенте муравьиной кислоты от 0 до 6 М или ступенчато в этом же интервале.Тринуклеотиды элюируют аналогично динуклеотидам и дополнительно 0,8 М раствором формиата 15 аммония в 4 Ы муравьиной кислоте. Элюцию проводят со скоростью 18 - 20 мл см /час.гМононуклеотиды упаривают в вакууме при температуре 30 - 40" С, а олигонуклеотиды лиофилизируют, 20В случае необходимости олигонуклеотиды переводят в натриевые и другие соли нейтрализацией щелочью до рН 7,0 - 7,5 и лиофилизируют.Фракции высших олигонуклеотидов элюируют 2 М ацетатом аммония, упаривают и гидролизуют 25 щелочью или фосфодиэстеразой и выделяют хроматографией уксусной кислотой на анионите АВ - 17. Формула изобретения 1. Способ выделения олигонуклеотидов из рибонуклеазного гидролизата РНК путем его двухступенчатой сорбции на колонках с анионитом, элюирования на первой ступени солевым раствором, а на второй - муравьиной кислотой и формиатом аммония с последующим концентрированием одним из известных способов, например лиофилизацией, о т - лича ющийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения чистоты и выхода олигонуклеотидов, первую ступень элюирования осуществляют при повышенной температуре, преимущественно равной 50-90 С. 2, Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что сорбцию на первой ступени осуществляют на анионите Эктеол - целлюлозе, а на второй - на АВ - 17.3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что элюцию на первой ступени проводят ступенчато водносолевым раствором.