Способ биохимического исследования компонентов соединительной ткани

ЕТЕЛЬСТВ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(56) Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. М.: Л.: 1969.с(54) СПОСОБ БИОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПОНЕНТОВ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ(57) Изобретение относится к клинической биохимии .и может быть использовано для оценки степени патологического процесса в1 Изобретение относится к клиническойбиохимии и касается комплексного биохимического исследования соединительнойткани,Целью изобретние объема ткани, ндования.Указанная цель достигается тем, что вспособе биохимического исследования компонентов соединительной ткани путем ее:гидрорлиэа и определения коллагена и протеогликанов, ткань предварительно инкубируют с папаином в дозе 10 - 1000 мг/г врастворе 0,1 - 1,0 М ацетатного буфера в течение 6 - 48 ч, затем из гидролизата отбирают две пробы, в одной из них определяютколлаген по оксипролину, в другой - протеогликаны по гликозаминогликанам,Инкубирование ткани с папаином а дозе 10 - 1000 мг/г в растворе 0,1 - 1,0 М ацетатения является уменьшееобходимого для исслетканях, формирующих элементы сустава, Цель изобретения - уменьшение объема ткани, необходимого для исследования, Новым в способе является то, что один (даже очень малый) образец ткани предварительно инкубируют с папаином (10+1000 мг/г) в растворе 0,1+1,0 М ацетатного буфера до визуального растворения ткани (в течение 6+48 ч), затем иэ полученного гидролизата отбирают две пробы, в одной из них определя.ют коллаген по оксипролину, .в другой протеогликаны - по гликозаминогликанам, Способ позволяет определять специфические компоненты влюбых тканях - хряще, синовиальной оболочке, сухожилиях,мениске и т.д. ного буфера в течение определенного времени (в зависимости от типа исследуемойткани) позволяет перевести образец в жидкое состояние, что облегчает последующееразделение малого объема ткани на две про-,бы для комплексного биохимического, исс-ледования,Меньшее, чем 10 мг/г количество папаина и меньшая, чем 0,1 М емкость буфера непозволяют полностью выделить гликозаминогликаны даже иэ той ткани (хрящ), из которой они выделяются при наиболее мягкихусловиях протеолиза. Увеличение количества папаина более 1000 мг/г ткани и повышение емкости буфера свыше 1,0 Мнецелесообразно, т.к, не дает дополнительно. го положительного эффекта, а лищь приводитк дополнительному расходываниюреактивов,Продолжительность протеолиза менее6 ч не позволяет полностью выделить всегликоэаминогликаны, содержащиеся в ткани, а увеличение времени инкубации более 48 ч нецелесообразно, т,к. за 48 ч происходит полное растворение исследуемых тканей,Способ осуществляют следующим образом.После взвешивания (при необходимости обезвоживания, обезжиривания) ткань инкубируют с папаином (10 - 1000 мг на 1 т ткани) в растворе 0,1-1,0 М ацетатного буфера"до визуального растворения ткани (6- 48 часов), Полученный гидролизат делят на две пробы, В одной пробе проводятопределение содержания коллагена, по входящему в его состав оксипролинупосле гидролиза в соляной кислоте. В другой пробе проводят определение содержания протеогликанов по входящим в их состав гликозаминогликанам после депротеинизации пробы, осаждения и очистки гликозаминогликанов.П р и м е р. Исследование компонентовсуставного хряща надколенника, полученного при пункцион ной биопсии больного артрозом. Хрящ массой 5 мг обезжирен эфиром, высушен на воздухе при комнатной температуре, помещен в бюкс с притертой пробкой. В бюкс добавлен 1 мл 0,1 М рас твора ацетатного буфера рН 5,7-5,8, содержащего 50 мг папаина и его активаторы ЭДТА. и 3.-пистеин (по 0,1 М) на 1000 мл буфера. Протеолиз,проведен при 60 й 40 С при периодическом встряхивании в течение 6 часов. Из гидролизата отобраны две пробы - 0,02 и 0,2 мл, В меньшей пробе проведено определение коллагена по оксипролину, К 0,02 мл гидролиэата, помещенного в ампулу, добавляют 2 мл 6 н раствора соляной кислоты, ампулу запаивают, помещают в термостат при 110 С на 20 часов, ампулу вскрывают, соляную кислоту выпаривают досуха, Остаток растворяют в 2 мл воды и проводят определение оксипролина, добавляя 1 мл забуференного реактива окислейия (состоящего из 2,82 г хлорамина Т или В, растворенного в 40 мл воды и 60 мл метанола и 100 мл ацетет-цитратного буфера рН 6,0), оставляя пробу на 20 мин при комнатной температуре, добавляя потом 1 мл 4 М раствора хлорной кислоты, встряхи-.вая, оставляя на 5 мий при комнатной температуре, добавляя 1 мл 10% раствора пара-диметилбензальдегида в метаноле, фотометрируя при длине волны 560 нм. Содержание оксипролина 26 мг/г ткани.В большей пробе проведено определе":йие содержания протеогликанов по глико заминогликанам. К 0,2 мл .гидролизатадобавляют трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 10%, оставляют при50 формула изобретения Способ биохимического исследования компонентов соединительной ткани путем ее гидролизэ и определения коллагена и протеогликанов, о т л и ч э ю щ и й с я тем, что, целью уменьшения объема ткани, необходимого для исследования, ткань предварительно инкубируют с папаином в дозе 10 - 1000 мг/г в 0,1 - 1,0 М ацетатном буфером растворе в течение 6-48 ч, затем иэ гидролизата отбирают две пробы, в одной иэ них определяют коллаген по оксипропину, в другой - протеогликсану по гликозаминогликанам. 4 С на 4-24 ч, Остаток отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30мин. Осаждение гликозаминогликанов изнадосадочной жидкости, содержащей трих 5 лоруксусную кислоту, проведено с помощьюдобавления к ней 96 зтанола, содержащегосоли натрия или калия уксусной кислоты доконечной концентрации этанолэ 67. Пробатщательно перемешана и оставлена при 4 С"0 на 12-24 ч, Осадок отделен центрифугиро-,ванием, растворен в воде и гликозаминогликаны повторно осаждены, В осадкегликозаминогликанов определяли содержание уроновых кислот, добавляя к нему 0,1 мл"5 0,5 М раствора борной кислоты, 0,2 мл 1 Мраствора сульфаминовой кислоты и 2,5 млконцентрированной серной кислоты, тщательно перемешивают, нагревая на кипящей водяной бане 6,5 мин, охлаждая,20 добавляя 0,1 мл 0,2% раствора карбэзола вэтаноле, пробу тщательно смешивая и повторно нагревая на кипящей водяной бане10 мин, охлаждая и измеряя полученнуюокраску на спектрофотометре при длине25 волны 525 нм. Содержание гликозэминогликэнов 5,7 мг/г ткани,Исследование компонентов соединительной ткани синовиальной оболочки, сухожилия надколен ника и мениска30 коленного сустава проводится аналогичнымобразом, при этом учитывается масса ткани,Молярность буфера и количество растворя: емого в нем папаина, а также время инкубации определяются типом анализируемой35 ткани.Предлагаемый способ позволяет упростить процедуру исследования ткани путемсокращения ряда приемов и расширить возможности его клинического применения за40 счет исследования минимальных количествткани, например, биоптатов, провести комплексное биохимическое Исследование дляполучения необходимой информации о состоянии волокнистых структур и матрикса45 соединительной ткани.