Способ определения нарушения целостности мембран эритроцитов при рентгеновском облучении

(71) Институт зоологии АН КазССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЯ ЦЕЛОСТНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ РЕНТГЕНОВСКОМОБЛУЧЕНИИ ование: биохимия, клиническаяСущность изобретения: эрите рентгеновского облучения отинкубируют в изотонической жащей 2 мМ АТФ и 2 мМ Мд Н С при р Н 7,5 для определения мМ АМФ, 30 мМ Мд, 145,0 мМ и рН 8,6 для определения 51- ы. Способ позволяет опредеждение эритроцитов в первые облучения. Для исследования я нативные эритроциты, не обдетергентами. Табл. 1. ок 0,30-ным раств 80, тритон хи стный способ являет наличие урограф окоскоростной цен тения -упрощение ния числа операци биохимии идназначеноелостности Изобретение относится кклинической гематологии и предля определения нарушения цмембран эритроцитов.Известен способ определения нарушений целостности мембран эритроцитов, заключающийся в том, что проба крови с энтикоагулянтом гепарином инкубируется в термостате при 37 С 1 ч, затем выделяется фракция эритроцитов в объеме 0,5 мл, в нее добавляется детергент и наносится на поверхность 3600-ного раствора урографина, центрифугируется при 15000 д 20 мин. После этого отбирается верхняя зона, а также отдельно собирается осадок, растворяется в дистиллированной воде и измеряется оптическая плотность каждой фракции при 380 нм, По калибровочной кривой, полученной путем сопоставления количества эритроцитов после подсчета их в камере Горяева и соответствующей оптической плотности этих же проб после гемолиза, определяют количество образующих каждую зону, Способ позволяет определить нарушение целостности мембран эритроцитов только после обработки клет тергентов (твинОднако изве доемким, требу тергентов и высЦель изобре за счет сокрэще цедур. ором дедр) ется труинэ, детри фугиспособа й и проСпособ осуществляется следующим образом.Эритроциты крыс после общего рентгеновского облучения в дозе 7,6 г отмывают, инкубируют в изотонической среде 2 мМ АТФ и 2 мМ Мд, 50 мМ трис-НС при рН 7,5 для определения АТФ и 2 мМ АМФ, 30 мМ Мд, 145 мМ трис-НС при рН 8,6 для определения 5-нуклеотидазы. Расчет активности ферментов проводят по выходу неорганического фосфата, выделенного 1 млн, клеток за 1 ч инкубации, Количественное определение неорганического фосфата проводят по общепринятому методу с помощью раствора молибдата аммония и хлористого олова, Окраска развивается при комнатной ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(57) Испол ьз гематология роциты посл мы Вдют и среде, содер 50 мМ трисАТФазы и 2 трис-НС пр нуклеотидаз лить повре сутки после испол ьзуютс работанны,е 35777 АЗаказ 1813 Тираж ВНИИПИ Государственного ко 113035, МоПодписноеитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССква, Ж, Раушская наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина 101температуре через 20 мин и в дальнейшем не изменяется.Активность ферментов, локализованных на наружной мембране через 3 ч после облучения, резко увеличивается и составляет для 5 -нуклеотидазы 186 оот исходного уровня, а для АТФазы 196% соответственно, Результаты эксперимента приведены в таблице.П р и м е р. Выделенные и отмытые после облучения животных эритроциты помещают в субстратную среду, содержащую 2 мМ АТФ и 2 мМ М 9, 50 мМ трис-НС при рН 7,5 для определения АТФазы и 2 мМ АМФ, 30 мМ Мд +, 145 мМ трис-НС при рН 8,6 для определения 5 -нуклеотидазы, инку 1бируют в термостате при 37 С 1 ч, количество поврежденных эритроцитов через 3 ч 26,59 + 5,75 млн. клеток, а активность 5- нуклеотидазы, АТФ увеличивается и составляет 186%. от исходного уровня, а активность АТФ - 196%.Для проверки степени корреляции целостности мембраны с активацией гидролиза АМФ и АТФ в первые часы после облучения нами применен .-токоферолацетат как средство, стабилизирующее мембраны. Для этого животным за 18 ч до облучения внутрибрюшинно вводят :токоферолацетат в дозе 30 мг на 100 г массы. Количество поврежденных эритроцитов через 3 ч после облучения на фоне введения мало чем отличалось от такового при облучении и только 24 ч после облучения приближалось к уровню исходных величин уинтантных животных (116,4% + 5,9%) от5 контроля, Активность АТФ и 5 -нуклеотида 1зы составляет в эти сроки 157 и 91,2%, ачерез 24 ч 139,7 и 75%. Структурная целостность мембраны, модифицированная токофероацетатом, коррелирует с активностью10 мембраносвязанных ферментов 5 -нуклеотидазной и АТФ.Предлагаемый способ позволяет определить повреждение целостности мембранэритроцитов в ранние сроки после облуче 15 ния в любой клинической лаборатории.Способ более экономичен, не требуетдорогостоящих реактивов и оборудования,а также более корректен, так как используются нативные эритроциты, не обработан 20 ные детергентами.Формула изобретенияСпособ определения нарушения целостности мембран эритроцитов при рентгеновском облучении путем инкубации25 эритроцитов и регистрации показателя проницаемости мембран, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения способа, регистрируют активность 5 -нуклеотидазы иАТФ-азы в эритроцитах, при увеличении ак 30 тивности через 3 ч после облучения животного определяют нарушение целостностимембран эритроцитов,