Способ выделения матриксного белка м1 ортомиксовирусов

ОВЕС ИХИСТИЧЕСКИХ СОУОЗ СОЦИО А ЕСПУБЛИК 191 3 ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТКРЫТИЯМ Е ИЗОБРЕТЕИДЕТЕЛ ЬСТВУ ПИ СКО А Д.И.Иванов 3, ч.54, р,гооду, 19 МАТРИКСНОИ РУСОВ к биологии и ния является егирован ного миксовирусов поэтапной де(21) 4787627,13(71) Институт вирусологии имского(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯГО БЕЛКА М 1 ОРТОМИУСОВ(57) Изобретение относитсямедицине, Цеью изсгр:тполучение нативно о неаггматриксного белка М 1 опттипа А, В. Цель достигается Изобретение относится к биологии, а именно вирусологии, и касается выделения матриксного белка М 1 ортомиксовирусов.Целью изобретения является получение нативного неагрегированного матриксного белка М 1 ортомиксовирусов типов А, В.Для достижения цели разработан прием поэтапной депротеинизации вирусов гриппа типов А, В и с помощью неионного детергента при различных рН, На первом этапе посредством воздействия детергента в нейтральной среде (рН 6,8 - 8,0) осуществляют растворение липидной оболочки вирионов и удаление поверхностных гликопротеидов с сохранением внутреннего нуклеида. На втором этапе обработка полученного вирионного нуклеоида детергентом в кислой среде (рН 3,0 - 4,5) приводит к избирательной солюбилизации матриксно(5)5 С 12 М 7/00, А 61 К 39/00 протеинизацией вирионов с помощью неионного детергента при различных рН. На первом этапе депротеинизирующего воздействия при нейтральном рН получают вирусные нуклеоиды, содержащие белок М 1, На втором этапе при обработке нуклеоидов в кислой среде с рН около 4,0 происходит селективная солюбилизация М 1 Таким образом, разработанный способ, лишенный дснатурирующих воздействий, позволял получить в растворимом состоянии нативный белок М 1 ортомикровирусов А, В. Разработанный способ может иметь широкое пригленение в медицин- при разр-ботике диагнсстикумов и вакцинньх препаратовв биологии для структурных и 1 ункциочальньх ис"ледований белков и с;5 в, рчс ыхктур го белка М 1, что делает возможным его получение после удаления вирусного рибонуклеопротеида (РНП). Такой способ выделения, лишенный какого-либо денатурирующего воздействия, исключает агрегацию М 1 и позволяет получить его в нативном состоянии в растворимой форме.П р и м е р. Вирусы гриппа А/О/ЯГ 4/33(Н 1 М 1), А/АсГ/2/68(НЗМ 2), А/ТРИР/еуопбде(Н 7 И 7), В/ее/40, размно. жают в 9-дневных куриных эмбрионах при 36 С в течение 48 ч, кроме вирусов В/атее /40, которые инкубируют 72 ч при 32 С. Вируссодержащую аллантоисную жидкость (А;К) разводят раствором Хзнкса до концентрации вируса 256-512 ГАЕ/мл и осветляют при 11000 д 30 мин, Осветленную АЖ наслаивают на двухступенчатый градиент глицерина (8,5 мл вирусного материала на одну проб ркуградиента), в котором верхний слой(интер- слой) состоит из 3,5 мл 10%-ного раствора глицерина, приготОвленного на езде без каких-либо добавок, а нижний слои ,базовый слой) состоит из 4,3 мл 20 -ного глицерина, содержащего 25-100 мМ МаС, 20 трипсин ингибирующих единиц (ТИЕ) на 1 мл апро тинина (контрикал В, ГЕРМЕД-ГДР), 1,ь детергента нонидет Р(МР 40) и 5 мМ трис-гидроксиметиламинометана, доведенного до рН 6,8-8,0 морфолинэтансульфоновой кислотой (МЭС), либо гидроксиэтилпиперазинэтансульфоновой кислотой (ГЭПЭС). Для выделения вирионных нуклеоидов градиенты центрифугируют при 20000 об/мин и при 15 - 18 С в роторе ЯО/28.1 (Ярпо Е) В ходе центрифугирования у вирионов при прохождении базового слоя происходит растворение наружной липопротеидной оболочки под действием детергента МР, В результате, солюбилизированные вирусные гликопротеиды задерживаются в глицерине, в нуклеоиды проходят базовый слой и оседают на дно пробирки.После центрифугирования аккуратно удаляют жидкую фазу градиентов и полученные осадки (вирусный нуклеоид) из 3 - 4 пробирок суспендируют в 350 мкл 10-ного глицерина, содержащего 50 - 200 мМ МаС 1.20 ТИЕ/мл апротинина, и 0,1 - 0,5;6 МР, Полученную суспензию делят на части по 10 п мкл, к которым добавляют 10 - 30 мклЛ Фос Ф а т н о(М а-,Н гОл)-цитратного т) либо цитратного (СбНВОт.7 Ча ) буфЕра С раэл 1 чным рН В дидпдзс 3,0 - 6,2, После пичетирования суспенэию наслаивают на 0,5 мл 20-ного глицерина, приготовленного на воде, и центрифугируют в растворе ЯП 65 при 23000 об/мин (12 С) в течение 1,5 - 2,0 ч (ЗреИо (.-5), После центрифугирования отбирают верхний слой в обьеме 120 - 150 мкл, удаляют 20-ный глицерин и сохраняют осадок.Качественную и количественную оценку полипептидного состава получечных фракций проводят на основании электрофореза белков в полиакриламидном геле, содержащем додецил сульфат натрия с буферной системой аеп 1 п 1. После электрофореза гели окрашивают Кумаси Р(рЬаггпаса) и отмывают смесью уксусной кислоты (76) с этанолом (5 с последующим сканирова 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 нием окрашенных гелей в видимом свете на спектрофотометре Весгпап СОЯ.Далее прс водят второе Фракциони рсва. ние, при котором препарат нуклеоида суспендируют в 10 6-ном глицерине. содержащем фосфатно-цитратный либо центратный буфер с различным рН в диапазоне 3,0 - 6,2. Полученную суспензию центрифугируют для осаждения вирусных РНП. Полипептидный состав осадка и супернатанта анализируют с помощью электрофореза. Как показал анализ, при суспендировании при рН более 4,5 матриксный белок М 1 сохраняет связь с РНП и осаждается с ним через раствор 206-ного глицерина и отсутствует в соответствующей Фракции супернатанта. При суспендировании в буфере в диапазоне рН 3,0 - 4,5 белок М 1 избирательно диссоциирует с РНП и переходит во Фракцию супернатанта и практически отсутствует в соответствующих фракциях осадка,В результате анализа можно заключить, что изолированный предлагаемым способом белок М 1 находится в растворимом состоянии преимущественно в форме мономеров, Аналогичные результаты по выделению белка М 1 чри ислы рН получены для всех исследованных штаммов вируса гриппа типов А. ВСпособ может иметь широкое применение в медицине пои разработке диагностикумов и вакуумных препаратов 1 в б 1 ологии для Структурных и Функционэльнык исследований белков и счбвируснык структур.Формула изобретения Способ выделения матриксного белка М 1 ортомикссвирусов путем избирательной солюбилизации его из еиоионов. о т л и ч а. ю щ и й с я тем, что. с целью получения нативного неагрегиоованного белка М 1, солюбилизацию осуществляют путем депро. теинизации вирионов воздействием 0,5 - 1,0 онеионного детергента Г 4 Рили Тгч в нейтральной или слабощелочной среде с 2 - 20 мМ трис-МЭС или трис-ГЭПЭС буфера (рН 6,8 - 8,0), с последующей обработкой 0,1 - 0,44-ным неионным детергентом Г 4 Рили ТМв кислой среде (рН 3,0 - 4,5) с 5 - 30 мМ цитратнсго или Фосфоцитратного буфера и получением конечного ПРОДУКта В РЕЗУЛЬтатЕ ОчИСтКИ Л 1 атЕРИаЛа От вирусного РНП центрифугироеанием.