Способ получения никотинамидадениндинуклеотида (над)

)5 С 12 Р 19/36/ С 12 В 1:13) 12 Р 19/36,ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКРЫТИЯМ Я ИЕ ИЗОБРЕТ И АВТОРСКОМУ С ТЕЛЬСТ относится к биотехн олучения биологическ с помощью микроорг 21) 4724460/13(71) Институт биохимии им. А.Н, Баха и Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энэимологии(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИКОТИНАМИДАДЕ Н ИНДИНУКЛ ЕОТИДА (НАД)(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения никотиИзобретение ологии, к области п и активных веществ анизмов,Целью изобретения является повышение выхода НАД и сокращение продолжительности процесса.Процесс получения НАД методом глубинной ферментации можно рассматривать как двухстадийный. На первой стадии происходит накопление биомассы, а на второй, которая начинается после внесения в среду ПАВ и предшественников, размножение культуры прекращается и происходит синтез НАД. В качестве продуцента используют культуру ВгечЬас 1 егов аввопадепез АТСС 6872, которую выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, магния, кальция, стимуляторы намидадениндинуклеотида (НАД). Цель изобретения - повышение выхода НАД и сокращение продолжительности процесса. Культуру ВгечЬассегов аввопадепез АТСС 6872 выращивают на первой стадии на питательной среде при дробном внесении источников азота и фосфора, Поверхностно-активное вещество вносят в количестве, составляющем 5-70 от количества биомассы. На стадии биосинтеза после введения в среду предшественников НАД культивирование осуществляют при рН 6,5 - 7,0 до достижения максимального количества в среде целевого продукта. Выход НАД 5,7 - 6,5 мг/мл. Продолжительность процесса 60-72 ч,роста, При этом источники углерода и азота вносят дробно по мере их исчерпания в пи- а тательной среде. Культивирование ведут до (, накопления биомассы не менее 12 мг/мл (по сухому весу), после чего вносят ПАВ и предшественники биосинтеэа НАД. ПАВ вносят в количестве, составляющем 5-70/О от количества биомассы. Было установлено, что выход НАД в сильной степени зависит от,4 соотношения ПАВ и биомассы. Отклонение от указанного интервала приводит к резкому снижению выхода НАД. Дальнейшее а культивирование ведут для биосин 1 еэа НАД, поддерживая рН в среде в пределах 6,5 - 7,0, в течение 36 - 42 ч до достижения максимального количества НАД в среде, Вне укаэанного интервала рН выход НАД значительно ниже. Культивирование в предлагаемых условиях позволяет стабильно1693057 Составитель О.СкородумоваРедактор О, Юрковецкая Техред М.Моргентал Корректор Э.Лончакова Заказ 4052 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 получать высокий выход НАД (5,7 - 6,5 мг/мл),П р и м е р 1, Культуру ВгенЬас 1 егцщ агпвопацепеэ АТСС 6872 выращивают при 8 - 32 С в аэробных условиях на питательной среде следующего состава,: глюкоза 10, КН 2 РО 1; К 2 НРО 4 1; М 95047 Н 20 1; СаС 2 0,01; дрожжевой экстракт 1, мочевина 0,6; биотин 3 мкгГлюкозу, мочевину и биотин в виде водных растворов стерилизуют по.отделы. асти и вносят в среду перед посевом, Для посева используют 10% жидкого инокулята, полученного при выращивании культуры на среде, содержащей,: глюкоза 2; пептон 1; дрожжевой экстракт 1; МаС 0,3; биотин 3 мкг%. Через 24 ч роста вносят в культуральную жидкость цетилпиридинийхлорид (ЦПХ) в количестве 1 мг/мл, никотинамид и аденин по 2 мг/мл, Культивирование продолжают еще 72 ч для достижения максимального выхода НАД, составляющего 2 мг/мл,П р и м е р 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но перед посевом вносят все количество биотина (3 мкг) и половину заданного количества глюкозы и мочевины (5 и 0,3 осоответственно), При выращивании продуцента по мере исчерпания глюкозы в питательной среде добавляют остальное количество глюкозы и мочевины в два приема (через 12 и 20 ч от начала культивирования), После 24 ч роста биомасса достигла 15 мг/мл (по сухому весу), В это время вносят ЦПХ в количестве 0,75 мг/мл, что соответствует 5,0 оот количества биомассы, затем добавляют аденин и никотинамид по 2 мг/мл каждого. Культивирование продолжают в течение еще 36 ч, поддерживая рН в среде в интервале 6,5- 7,0 с помощью 10 о -ного МаОН или 10%-ного ИН 4 ОН, Выход НАД достигает 5,7 мг/мл,П р и м е р 3, Способ осуществляют согласно примеру 1, но ЦПХи предшественники вносят после 30 ч роста продуцента,Концентрация биомассы составляет к этомувремени 18 мг/мл, поэтому ЦПХ вносят вколичестве 1,26 мг/мл, что соответствует7;0% от количества биомассы, Культивиро 5 вание продолжают в течение еще 40 ч и приэтом выход НАД достигает 6,5 мг/мл.П р и м е р 4, Способ осуществляютсогласно примеру 1, но исходное содержание глюкозы в питательной среде составля 10 ет 7, а мочевины - 0,45%. Через 30 ч ростав среду вносят оставшееся количество глюкозы и мочевины (3 и 0,15% соответственно), никотиновую кислоту и аденозин по 2мг/мл и цетилтриметиламмонийбромид15 (ЦТАБ) в количестве 0,9 мг/мл, Это количество ЦТАБ выбрано, исходя из того, что вмомент его внесения концентрация биомассы в среде была 17 мг/мл. Культивированиепродолжают еще 42 ч и получают НАД 6,220 мг/мл.Таким образом, способ позволяет увеличить выход НАД на 185 - 225 и сократитьвремя процесса с 96 до 60 - 72 ч,Формула изобретения25 Способ получения никотинамидадениндинуклеотида (НАД, предусматривающийстадию культивирования продуцентаВгенЬастегцв атвопа 9 епез АТСС 6872 напитательной среде, содержащей источники30 углерода, азота, фосфора, магния, кальция,и стадию биосинтеза НАД в присутствииповерхностно-активного вещества и предшественников НАД, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения выхода НАД и35. сокращения продолжительности процесса,источники углерода и азота на стадиикультивирования вносят дробно по мереисчерпания их в питательной среде и культивирование ведут до накопления биомассы40 в количестве 12-18 мг/мл среды, а биосинтез НАД осуществляют при рН 6,5 - 7,0 исодержании поверхностно-активного вещества в среде 5-7% от количества накопленной биомассы.45