Способ оценки повреждений генома ооцитов лабораторных животных

СООЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 0 ТЕНИ и гинекологии Ю, Ливотова во СС ВРЕЖДЕНИ Й БОРАТОР НЫХ я к эксперимении и может быть ой генетике для разных поврежль ввов дозе асчета ействия. Производиания животных, зана доске. Самок ции в течениеч. ом. Мутаген прямого ился внутрибрюшин 1 кг веса животее воз движиспин обилиз мутаген ан вво 1 г н Стрессирующ лось путем обез крепляя их на подвергали имм Воздействие действия - урет но из расчета ного (1 г/кг). Воздействие Д-дихлорфенокс ся одноразово 10 мг/кг.ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБР К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ПГЕНОМА ООЦИТОВ ЛАЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относитстальной медицине и биологиспользовано в медицинскизучения действия разнооб Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии и может бытьиспользовано в медицинской генетике дляизучения механизмов повреждения созревающих ооцитов при различных неблагоприятных воздействиях, таких как воздействиехимическими мутагенами, алкогольная интоксикация, радиоактивное облучение, стресс идругие.Цель изобретения - снижение трудоемкости способа,Пример, Работа выполнялась на самкахкрыс линии Вистар весом 160 - 200 г, полученных из питомника лабораторных животных АМН СССР Рапполово,Животные в течение 3 - 4 недель содержались в стандартных условиях вивария наобычном брикетном питании с добавлениемовощей и творога при дозированном освещении (12:12). После 3-недельной адаптации к световому режиму путем исследования вагинальных мазков выявлены животные с нормальным 4-дневным эстральнымциклом и определены у них времена. естест,ЯО, 163079 дающих факторов на созревающие ооциты. Цель изобретения состоит в снижении трудоемкости способа. Способ оценки повреждений генома ооцитов лабораторных животных включает определение момента начала естественной овуляции животных, осуществление неблагоприятного воздействия в преовуляторном периоде и опосредованную оценку состояния ооцитов путем определения уровня микроядер в клетках кумулюса. Способ позволяет оперативно оценить влияние вредных факторов среды на репродуктивные функции животных при ограниченном количестве используемых лабораторных животных. 1 табл,веннои овуляции по времени появления проовулировавших ооцитов в ампуле яйцеводов.Весь преовуляторный период разбивался по стадиям мейоза, и воздействия производились на стадии проэструс. Использовались следующие типы неблагоприятных (повреждающих) воздействий.Алкогольная интоксикация. Алкого дился однократно, внутрижелудочно 9 г/кг веса 40% его раствора (из р 3,6 г/кг 10000-ного раствора). мутагеном (гербнцид 2,4 --иуксусная кислота), Вводилвнутрижелудочно в дозеЧастота клеток ДОСТОвеРДостоверность ОтЛИЧИй ОтСмертность эмбрионов при воздействиях, Е кумулюса с микроядрами(на 1000клеток) ность отлиЧий ОТ КОНТконтроля роля 25,5 25,2 Не изучали 43,9 9,539 39 7 8 10 12 17 15 10 2 О, 001 0,001 0,001 0,01 АЛКОГОЛЬ Стресс Уретан 2,4-ДКонтроль О, 0010,001Не изучали0,001 Животных забивали после наркоза путем декапитации не позднее 5 ч от начала овуляции. Из ампулы яйцеводов извлекали проовулировавшие ооциты, которые к этому времени находились на стадии метафазы 11. Ооциты с клетками кумулюса помещали в лунку со средой (среда 199, температура 37 С), добавляли кристаллы гиалуронидазы для отделения ооцитов от клеток кумулюса. Клетки кумулюса помещали в маленькую пластиковую пробирку со средой 199 и несколькими каплями женской сыворотки для инактивации фермента. Кумулюс далее центрифугировали в течение 5 мин (1000 об/ /мин), сливали надосадочную жидкость и добавляли порцию охлажденного фиксатора (+4 С, 1 ч ледяной уксусной кислоты на 3 ч метилового спирта). Осадок ресуспензировали и снова центрифугировали в течение 5 мин, Сливали надосадочную жидкость и приливали вторую порцию фиксатора, размешивали, центрифугировали в течение 5 мин. Затем кумулюс в небольшой порции фиксатора наносили каплями микропипеткой на предметное стекло. Стекло подсушивали на спиртовке, клетку кумулюса окрашивали красителем Романовского-Гимза.Анализ клеток кумулюса проводился под микроскопом при увеличении иммерсионного объектива 90,Частоту встречаемости микроядер в препарате определяли на 1000 просмотренных клетках кумулюса.Полученные результаты отображены в таблице, В таблице приведены также данные о смертности эмбрионов при исследованных неблагоприятных воздействиях и данные по контрольной группе животных, не подвергавшихся неблагоприятным воздействиям (контроль).Из таблицы следует, что воздействие неблагоприятных факторов в преовуляторном периоде приводит к гибели эмбрионов. При этом в клетках кумулюса увеличивается число микроядер, Таким образом, частота микроядер в клетках кумулюса является показателем повреждающего действия факторов на геном ооцита, вследствие повреждения которого эмбрион теряет способности к нормальному развитию и гибнет. 5 10 15 20 25 30 Выполненные исследования наглядно свидетельствуют о том, что оценка повреждений генома ооцитов лабораторных животных при различных неблагоприятных воздействиях может быть быстро и эффективно проведена путем определения уровня микро- ядер в клетках кумулюса.Трудоемкость предлагаемого способа по сравнению с известными резко снижается за счет того, что исключены продолжительные операции поклеточного фиксирования ооцитов. Поскольку каждый ооцит окружен большим количеством клеток кумулюса, то более чем на два порядка возросло количество клеточного материала для цитогенетического анализа, получаемого от одного животного. Это позволяет использовать предлагаемый способ для широкомасштабных исследований с ограниченным количеством животных, а также применять его в качестве оперативного метода оценки влияния на репродуктивные функции лабораторных животных вредных факторов среды.При реализации предлагаемого способа сами ооциты сохраняются и могут быть использованы для дальнейших исследований по известным методикам.Экономический эффект от использования предлагаемого способа достигается за счет того, что сокращается продолжительность экспериментальных исследований и уменьшается число лаборантов. В частности применение предлагаемого способа вместо известного способа (базовый вариант) для оценки повреждений генома ооцитов при действии одного неблагоприятного фактора позволяет снизить число лаборантов от 3 до 1. Способ оценки повреждений генома ооцитов лабораторных животных, включающий определение момента начала естественной овуляции у животных, осуществление неблагоприятного воздействия на них в преовуляторном периоде, декапитацию животных, извлечение ооцитов и оценку состояния генома ооцитов, отличающийся тем, что, с целью снижения трудоемкости способа, состояние генома ооцитов оценивают по уровню микро- ядер в клетках кумулюса.