Способ определения в-лимфоцитов

,"; граб 1 .А С ВИДЕТЕЛ ЬСТВУ К АВТОР титут они и Мин- цинский я В-кле- техники кая иммедицине, а огии, к изууса, ение времея кмун ста окращСпОСОся сле ующим ОО ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯУЛПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗО(71) Научно-исследовательский инскологии и медицинской радиологиский государственный медиинститут(56) Зарецкая Ю,М. Идентифи;".цточных детерминант посредствомдвойного окрашивания - Клиничмунология, с. 61, 2, 3, б. Изобретение относиименно к клинической имчению иммунологическоЦель изобретения - сни анализа и упрощениеСпособ осуществляетразом. Сухую люминесцируощую сыворотку против глобулинов человека, меченную одним из флюоресцирующих агентов (например ФИТЦ, родамин или другой), растворяюл в .соответствии с инструкцией. Раствоо освобождают от нерастворяющихся примесей центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин,Выделенные на градиенте верофиколла лимфоциты дважды отмывают сребдой 199 и готовят взвесь, содержащую 2 10 клеток в 1 мл взвеси. К 0,5 мл взвеси лимфоцитов добавляют равный обьем предварительно, отцентрифугированной люминесцирующей антисыворотки, тщательно ресуспендируют и выдерживают при 37 С 20 мин при периодическом осторожном встряхивании,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В-ЛИМФОЦИТОВ(57) Изобретение относится к области медицины, а именно клинической иммунологии, Целью изобретения является упрощение способа и сокращение времени определения, Для этого после добавления к лимфоцитам люминесцирующей антиглобулиновой антисыворотки при прокрашивании на предметном стекле, его прогревают над пламенем спиртовки, тем самым сокращая время анализа на 3 ч и достигая упрощения способа,Взвесь л мфоцитов, обработанных антисы во ротко й, дважды отмывают 8 - 10-кратным обьемом изатонического раствора МаС. Осадок тщательно ресуспендируют и каплю его переносят на предварительно обезжиренное предметное стекло.К капле взвеси добавляют капиллярной пастеровской пипеткой небольшую каплю заранее приготовленного флюоресцирующего агента, способного прокрашивать лимфоциты и давать при просмотре в люминесцентном микроскопе иную по цвет- ности флюоресценцию. Содержимое капли перемешивают, покрывают покровным стеклом и прогревают над пламенем горелки до 60 ЯС.В зависимости от особенностей исполь-зованного для прокрашивания лимфоцитов флюоресцентного агента препараты либо сразу микроскопируют, либо после дополнительной обработки, повышающей эффективность окрашивания; Далее препараты подвергают люминесцентно-микроскопическому исследованию. Подсчитывают число1603306 Составитель Е,ВасильеваТехред М,Моргентал Корректор И.Муска Редактор И,Касарда Заказ 3382 Тираж 510 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 специфйчески светящихся В-лимфоцитов (точечное и кольцевое свечения) на 200 клеток, отчетливо идентифицирующихся в том же режиме микроскопии. Содержание В- лимйоцитов выражают в процентах.П р и м е р 1, Используют сухую кроличью люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф, Гамалея АМН СССР, меченную флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).Поскольку антитела, меченные ФИТЦ, дают зеленое свечение, то для мечения лимфоцитов используется этидиум бромид, который окрашивает лимфоциты в красный цвет. Для приготовления рабочего раствора этидиум бромида 1 мг его растворяется в 250 мл изотонического. раствора йаС ( - 10 - 10 моль/л. Рабочий раствор хранится-6при +4 ОС.Одну каплю рабочего раствора этидиум бромида добавляют непосредственно на предметное стекло во взвесь лимфоцитов, обработанных предварительно антиглобулиновой сывороткой, меченной ФИТЦ. Предметное стекло покрывают покровным и прогревают, равномерно пронося над пламенем спиртовки, до =430 С. При этом обеспечивается эффект окрашивания лимфоцитов, Далее препарат подвергают люминесцентной микроскопии с использованием иммерсионной системы (возбуждающий свет 480-700 нм, запирающие светофильт ры ЖС 18+ЖЗС 19), Лимфоциты при этом дают равномерное красное свечение, а В-лимфоциты - дополнительно специфическое точечное или кольцевое зеленое свечение, обусловленное связанными 10 антиглобулиновыми антителами, меченными ФИТЦ.Таким образом, предлагаемый способпозволяет упростить определение общего количества лимфоцитов, дискриминировать 15 В-лимфоциты и уменьшить время анализана 3 ч.Формула изобретения Способ определения В-лимфоцитов путем выявления поверхностных иммуногло булинов с помощью добавления климфоцитам люминесцирующей антиглобулиновой антисыворотки и окрашивания на предметном стекло флюоресцирующим агентом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с 25 целью сокращения времени анализа и упрощения способа, в процессе скрашивания лимфоцитов флюоресцирующим агентом предметное стекло прогревают над пламенем горелки до 60 С,ЗО