Способ определения иммуносупрессивного действия ксенобиотиков

(51)5 0 01 1 33/53 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1(71 ) Красноярский государственный медицинский институт(56 ) Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 198, Ф 7, с. 57-60. (54 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОСУПРЕССИ ВНОГО ДЕЙСТВИЯ КСЕНОБИ ОТИ КОВ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в ксенобиохимии и иммунотоксикологии. Изобретение позволяет оценивать иммунотоксичность метаболитов микросомального 1Изобретение относится к медицине и может быть использовано для проведения первичного скрининга веществ на иммуномодулирующую активность.Предлагаемый способ позволяет оценивать иммуномодулирующее влияние продуктов метаболизма ксенобиотиков,Цель изобретения - упрощение и повышение чувствительности способа.Способ осуществляют следующим образом.Микросомы печени жшей линии ВАЬВ/с или РВА/2 инкубируют в присутствии ксенобиотика (в опытах использован . акриламид), В 1 мл инкубационной смеси содержится 2-3 мг белка микросом, 0,2 М трис-НС 3. буфера (рН 7,2), 0,5 мМ ЭДТА; 150 мМ КС 1; 10 мМ МС 1, 9 мМ акриламида (А); 125 млн,клеток селезенки мьппей СВА, Общий объем инкубационной сМеси 2,4 мп. Реакцию ини 801587446 А 1 2окисления ксенобиотиков путем подсчета антителообразующих клеток в селезенке сингенных мышей, Целью изобретения является повышение чувствительности способа и его упрощение. Цель достигается тем, что проводится инкубация клеток селезенки мышей непосредственно в инкубационной смеси, состоящейиз О, 2 М трис-НСТ буфера, 150 мМ НС 1,1 О мМ МцС 1, 3 мМ НАДФН, 2 мг/мл инкубационной среды микросом печени машей, и осаждение клеток селезенки после остановки реакции при 1500 об/мин.Разработанный режим позволяет с высокой точностью оценивать иммунотоксичность метаболитов микросомальногоокисления ксенобиотиков,1циируют добавлением 3 мМ НАДФН, через 30 мин реакцию останавливают добавлением большого объема охлажденной до 4 С среды 99 с антибиотиками. Затем фьюоспленоциты осаждают центрифугированием при 1500 об/ьин (4 - 5000 ц) в течение 7-10 кн, Далее клетки дважды отмывают средой 199 центрифугировани- р ем в том же режиме и вводят в объеме 1 мл вместе с 4 х 10 эритроцитов барана внутривенно сингенным мышам-ре- . ципиентам. Для определения иммуностимулирующей активности используют дозу эритроцитов, равную (0,5-1) д 107 клеток, Мьппи-реципиенты за 3-4 ч до клеточного переноса получают внутрибре- феда шинно 200 мг/кг циклофосфамида для подавления собственной иммунореактивности. Через 5 дней определяют уровень иммунного ответа по числу антителообразующих клеток метоцом Ерне,1587446 формул а изобр етения Составитель П,Бонарцев Техред М.Дидык . Редактор О.Юрковецкая Корректор М,Пожо Заказ 2417 Тираж 511 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинатПатент", г,Ужгород, ул. Гагарина, 101 П р и м е р 1, Первоначально изучали иммунодепрессивное действие Апо известному способу. 9 мМ А инкуби-,ровапи с 0,2 М трис-НС 1 буфера (рН7,2), микросомами печени мышей ВАЯВ/сили РВА/2 в количестве 2-3 мг белка,150 мМ КС 1,. ЧО мМ МдС 1, О,б мМ ЭДТА,Объем инкубационной смеси 1 мп. Реакцию инициировали добавлением 3 мМНЛДФН и через 15 мин останавливали помещением проб в ледяную баню и добавлением 2 мп холодной инкубационной среды. Далее микросомы осаждали центрифугированием при 105000 д и 4 С в течение 1 ч. Полученный супернантант замораживали при -20 С и на следующийдень определяли его иммунодепрессивную активность, Размороженный супернат ант фильтровали через миллипо"ровый фильтр (диаметр пор 0,45 мкм)и инкубировали в течение 1 ч с нормальными клетками селезенки мышей СВА,Инкубационная смесь содержала 1 мпсупернатанта и 300 мпн,тест-клеток в1,4 мл среды 199. Затем клетки трижды отмывали центрифугированиеми в адоПтивном сингенномереносе опр еделяли ихиммунореактивность, как описано. Уровень иммунного ответа выражали в про пцентах к контролю (инкубация клетокв среде 199 ) . До стовер ность р азличийпри Р с 0,05 определяли с помощью критерия Стьюдента,Данные свиде тел ьствуют об от сут ствии достоверных различий между опытными и контрольной группами, Таким образом, при использовании известного способа не обнаружили иммунодепрессивного действия А.П р и м е р 2, Иммунодепрессивное действие А исследовали согласно предложенному способу.В,цанной постановке опыта было выявлено иммунодеприссивное действие А, которое обусловлено влиянием нестабильных метаболитов. При сравнении схем опытов и результатов, приведенных в примерах 1 и 2, подтверждается преимущество предлагаемого способа. Способ определения иммуносупрессивного действия ксенобиотиКов, включающий инкубацию ксенобиотиков с микросомами клеток печени мппей с последующей оценкой действия образующихсяметаболитов на тест-клети селезенкимппей в системе адоптивного сингенного переноса с подсчетом антителообра"зующих клеток, о т ли ч а ю щ и й -с я тем, что, с целью упрощения и повьппения чувствительности способа,тест-клетки селезенки инкубируют одновременно с ксенобиотиками и ьякросомами печени,