Способ определения лимфокинов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 151) 4 С 01 И 33/53 ПРИ НИЕ ИЗОБРЕТЕНИ в клиниче Томпсона ЧИМФОКИНОВ к биологии о к иммуявляется ения гепадостигауемого ра)е натв и ри ости о тлим лоисо д СУДАРСТВЕНКЫЙ КОМИТЕТ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ГКНТ СССР ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(57) Изобретение относитсяи медицине, преимущественннологии. Целью изобретения повьппение точности определ тотропного лимфокина. Цель ется путем внесения исслед вора на иммобилизирован Изобретение относится к биологии и медицине, преимущественно к иммунологии.Цель изобретения - повышение точ ения гепатотропного лимфокина,П р и м е р 1. От 15 мьппей ВА 1. В/с, самок, массой тела 18-20 г, которым вводят за 24 ч до исследования перорально 0,15 мл 77 СС 1 в подсолнечном масле для индукции репарационной регенерации печени, получают бластные клетки селезенки, центрифугируя взвесь клеток селезенки в растворе фикол-верографина плотностью 1,070, из расчета 510 клеток селе 7зенки на 2 мл раствора, при 250 я в течение 45 мин при 4 С. Клетки отмывают дважды центрифугированием в среде 199, разбавляя надосадок, содержадом носителе мембраны клеток печенив присутствии раствора радиоактивномеченого стандартного гепатотропноголимфокина с последующим выявлениемлимфокина по конкурентному ингибированиюсвязывания на носителе меченого лимфокина. Стандартный радиоактивно-меченыйгепатотропный лимфокин получают путеминкубации бластных лимфоцитов селезенки, полученных через 4-24 ч после индукции регенерации печени, в культуральной среде с радиоактивно-меченымиаминокислотами, с последующим высаливанием из культуральной жидкости при60-807 насьпцения серно-кислым аммонием. щий бластные клетки, в соотношени1:3, и суспендируют в среде 199 вобъеме 10 мл с 100 мкКи фС-меченаминокислот аланина, гистидина, ттофана, метионина, лейцина. Через6 ч инкубации клетки осаждают це)рифугированием и из надосадка высвают меченый фактор серно-кислыммонием при 607 насыщения, После 5кратной отмывки центрифугированиенасьпценным раствором серно-кислогаммония осадок растворяют в физиогическом растворе, забуференном тНС 1. Выделено 1,8 ф 10 СРМ-фактор6(счет в импульсах в минуту на сцитилляционном счетчике "Рак-бэта")Мембраны печени получают ультрцентрифугированием в градиенте плности сахарозы, забираяматериалгранице растворов 20/427 с после1481689ющим охлаждением мембран при 13000 я 15 мин. Связывание мембран с СИВг активированной сефарозой проводят по методике, рекомендуемой фирмой, из расчета 100 мкг белка мембран на 5.мл5 набухшей сефарозы в течение 16 ч при 4 С.Для связывания радиоактивно-меченого гепатотропного лимфокина с фиксированными на сефарозе мембранами печени к 0,1 мл суспензии сефарозы с иммобилизированными мембранами добавляют 0,05 мл С-меченого фактора4активностью 15 000 СРМ. Через 30 мин инкубации при комнатной температуре проводят отмывку несвяэавшегося фактора дважды по 5 мл холодного физиологического раствора, центрифугируя пробы при 600 я 2 мин и декантируя надосадок. Пробы ставят в дубликатах.Просчет радиоактивности в сцинтилляторе Брея показал связывание 3040+154 СРМ в пробе.П р и м е р 2, Тест-систему по примеру 1"используют для выявления немеченого гепатотропного лимфокина в исследуемой сыворотке мышей ВА 1, В/с, у которых индуцируют репарационную регенерацию печени введением перорально четыреххлористого углерода в количестве 0,15 мл 7 -ного раствора в масле, Используют пул сывороток от пяти опытных мышей в группах на З-й, 4-й, 5-й, 7-й и 14-й дни индукции регенерации от пяти интактных животных.Сыворотку в количестве 0,025 мл вносят в тест-систему перед внесением радиоактивно-меченого стандартного лимфокина. В присутствии сыворотки от интактных мышей связывание радиоактивно-меченого гепатотропного лимфокина составляет 2112+45 СРМ или 30,5% ингибирование связывания стандартного радиоактивно-мечвного лим 45 фокина в отсутствии сыворотки. На 3-й день регенерации ингибирование составляет 50,5% (1506+122 СРМ связывания), на 4-й день 51,3% (1481+3 СРМ связывания), на 5-й день 50,9%50 (1.492+4 СРМ связывания). На 7-й и 14-й дни, когда регенерационный процесс у мышей заканчивается, ингибирование связывания не отличается от такового для интактных животных: 34,5 55 и 28,8 соответственно.П р и м е р 3. Для получения тест-системы от 15 мышей ВА 1. В/с по лучают бластные клетки селезенки через 4 ч после индукции регенерационного процесса по примеру 1. Клеткив тех же условиях инкубируют 1 сути высаливают С-меченый факторфсерно-кислым аммонием при 80% насыщения. В качестве специфическогосорбента используют мембраны печени,фиксированные на 4 В сефарозе по примеру 1.При постановке реакции связывания17000 СРМ-фактора в 0,1 мл физиологического раствора инкубируют с мембранами печени в присутствии или без0,025 мл сыворотки контрольных иопытных мышей при комнатной температуре, отмывая и просчитывая результаты,В контроле связывается 1899+129СРМ-Фактора. В присутствии сывороткиинтактных мышей связывается 1452+81СРМ меченого фактора, что составляет11,5% ингибирования связывания встандарте. В группе опытных мышей на3-й день индукции регенерации печенипероральным введением 0,15 мл 7%-ногочетыреххлористого углерода связывание в присутствии сыворотки этих мышей составляет 1078+107 СРМ или38,5 ингибирования связывания стандарта.Формула и э обретения1. Способ определения лимфокинов,включающий введением их в тест-систему, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения точности определения гепатотропного лимфокина,в качестве тест-системы используютиммобилизованные на твердом носителемембраны клеток печени, содержащихсяв растворе радиоактивно-меченогостандартного гепатотропного лимфокина, а определение в пробе осуществляют по конкурентному ингибированиюсвязывания на носителе радиоактивномеченого лимфокина,2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве стандартного радиоактивно-меченого гепатотропного лимфокина используют белковую фракцию из культуральной жидкости, полученную путем инкубациикультуры лимфоцитов селезенки, выделенных через 4-24 ч после индукциирегенерации печени, а радиоактивномечеными аминокислотами и высаливанием при 60-80 -ном насыщении сернокислым аммонием.